[发明专利]用于细胞冷冻保存的无血清细胞冷冻保存液及其冷冻保存方法

说明书

本发明关于一种用于冷冻保存免疫细胞的细胞冷冻保存液及其冷冻保存方法，其中经细胞因子诱导的杀伤细胞尤佳。该细胞冷冻保存液的成分不含血清且由下列成分组成：(1)混合式基础培养基、(2)二甲基亚砜(DMSO)、(3)血清取代物、(4)右旋糖酐(Dextran)。其特征在于该保存液为混合式培养基及血清取代物以达成无血清冷冻保存功能。其用于免疫细胞尤其自然杀手细胞经解冻后可保持80％以上的细胞毒杀功能及功能性细胞标志，并具备高浓度细胞乘载量。

技术领域

本发明有关一种无血清细胞冷冻保存液及其冷冻保存方法，尤其是用于包含细胞因子诱导的杀伤细胞等免疫细胞的冷冻保存。

背景技术

相较于普遍使用的干细胞疗法，免疫细胞治疗为较新颖的细胞治疗技术。现行所使用的细胞冷冻保存液大多沿用干细胞保存液，专利项目亦多以干细胞或肿瘤细胞为主。然现今主流细胞冷冻保存液鲜有主张能够保存经细胞因子诱导的杀伤性免疫细胞，对于免疫细胞解冻后的功能性亦无相关验证信息。

免疫细胞相较于干细胞对于冷冻保存更为敏感，且冷冻过程对细胞会造成显著功能性损伤及细胞凋亡(J Immunol Methods.1989；125(1-2):185-9；J Immunol.1997；45(6):618-22.；J ImmunolMethods.2007；326(1-2):93-115；Faseb J.2002；16(12):1651-3.)。目前市售的细胞冷冻保存液大多适用于干细胞的保存，鲜有适用于免疫细胞，且宣称的功效仅限于细胞存活率，对于细胞功能的保存付之阙如。

因应未来免疫细胞制剂工业化生产制造、扩大业务范围、并确保产品有效性，冷冻保存技术不应只局限于细胞存活，亦须确保其细胞功能性得以保存。

此外，目前市售的细胞冷冻保存液，其细胞浓度的使用范围大多仅为0.5～10×10⁶/mL，在细胞制剂的工业化生产上，仍有进一步改进的空间。

发明内容

于是，本发明提供一种无血清细胞冷冻保存液，其冻存的细胞浓度可达1×10⁸/mL，细胞经解冻后，相较于冻存前可保持90％细胞存活率，适用于一般性渐冻盒及程序降温仪。

本发明的成分由下列成分组成的混合物：(1)混合式基础培养基、(2)二甲基亚砜、(3)血清取代物、(4)右旋糖酐。

于本发明的一些具体实施例中，其中该混合式基础培养基选自于罗斯威尔帕克纪念研究所培养基、干细胞生长培养基及AIM-V培养基或其组合。

于本发明的一些具体实施例中，其中二甲基亚砜的浓度介于2.5～10％(V/V)之间。

于本发明的一些具体实施例中，其中该血清取代物为血小板裂解液。

于本发明的一些具体实施例中，其中该右旋糖酐(Dextran)的浓度介于2.5～10％(V/V)之间。

于本发明的一些具体实施例中，其中该右旋糖酐(Dextran)的分子量介于40～78.5kDa之间。

本发明于另一方面，提供一种细胞冷冻保存方法，包含：将一细胞以上述的细胞冷冻保存液配制一细胞悬浮液；降温至-80℃；及置于液态氮中保存。

于本发明的一些具体实施例中，其中该细胞为一免疫细胞。

于本发明的一些具体实施例中，其中该免疫细胞为自然杀手细胞。

于本发明的一些具体实施例中，其中该细胞为CD56⁺细胞。

于本发明的一些具体实施例中，其中该细胞为CD56⁺CD16⁺细胞。