[发明专利]基于上转换纳米材料与BHQ-1共振能量转移的上转换荧光探针

说明书

本发明公开了一种基于上转换纳米材料与BHQ‑1猝灭基团荧光共振能量转移检测HE4的方法。首先通过溶剂热法合成聚丙烯酸修饰的上转换纳米粒子，再通过酰胺化反应将在5′端修饰有氨基，3′端修饰有BHQ‑1的适配体偶联固载到上述粒子表面，构建上转换纳米颗粒探针。因为BHQ‑1与上转换纳米颗粒之间能够发生荧光共振能量转移，所以上转换纳米颗粒的荧光可被BHQ‑1猝灭；加入目标物后，目标物与适配体之间具有更强亲和力，能量供受体间距离增大，阻断荧光共振能量转移，进而上转换纳米颗粒荧光恢复。可根据目标物不同浓度下，上转换纳米颗粒荧光强度恢复程度来实现对肿瘤标志物HE4的定量测定。本发明方法操作简便，灵敏度高，特异性强，有望用于卵巢恶性肿瘤的早期诊断。

技术领域

本发明涉及纳米材料和分析化学技术领域，尤其涉及一种基于上转换纳米材料与BHQ-1猝灭基团荧光共振能量转移检测HE4的方法。

背景技术

卵巢恶性肿瘤是目前国内外最常见的妇科癌症之一，其发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位，发病率为1.4％。随着科技，社会及医疗设施的不断发展，科学家们在肿瘤治疗如新药研发、医疗设施改进以及治疗方案的优化等方面做了相当大的努力，但其死亡率仍高居妇科恶性肿瘤首位，其五年内生存率仅为3～19％。其中，造成其死亡率居高不下的重要原因之一是缺乏准确进行早期癌症诊断的分析方法。据统计，70％的病人在初诊时已发展为晚期患者，这也极大的加剧了病人的死亡率。即便已经开发了许多用于早期诊断各种卵巢肿瘤标记物的分析方法，但因为卵巢癌症患者的早期病症并不明显，外加各种物理影像学检测费用高昂且费时，所以，对于许多早期无症状、又无家族疾病史的妇女进行早期卵巢恶性肿瘤的诊断收效甚微。因此，对病患进行卵巢恶性肿瘤的早期诊断对于改善卵巢恶性肿瘤患者的预后具有极其重要的意义。

人附睾蛋白4(HE4)是一种新型的卵巢肿瘤的特异性标志物，它的过量表达可促进卵巢癌细胞的增殖，浸润以及转移。与CA125相比，其在疾病早期阶段就有较高的特异性和灵敏度，因此HE4的检测在卵巢癌早期诊断中具有巨大的潜力。同时，HE4水平的变化与病程的发展有着密切的关系，所以 HE4在疗效评估和复发检测方面也有重要价值。

目前，对HE4肿瘤标志物进行早期检测的分析方法主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)，近红外光致发光法，电化学分析法，微流控芯片电泳法，荧光免疫法等等。然而，由于上述检测方法存在着检测灵敏度低、时间长、实验步骤繁琐、底物不稳定、成本高和样品量大等缺陷而极大限制了其应用和发展。因此，急需开发一类具有操作简单、方便快速、低成本且检测灵敏度高，检出限低的分析方法应用于HE4的早期分析检测。

近年来，上转换纳米粒子(UCNPs)由于其具有近红外(NIR)激发可见光区发射的特点，极大地减少了生物分子的自发背景荧光和光散射而在化学、生物医学等交叉领域备受关注。同时，基于UCNPs构建的上转换(UC)探针也被越来越多的应用于各种生物分子的检测。然而，由于UCNPs本身只能通过改变掺杂的稀土离子比来改变其发射波长，并且其表面没有任何识别单元，因此本身并未具有出色的传感行为。为克服上述技术缺陷，需要在UCNPs表面修饰合适的识别单元作为能量受体以构建能量转移体系，实现分析物的检测。截至目前为止，许多材料(如有机染料、贵金属纳米粒子和纳米簇、金属配合物、碳纳米及半导体纳米材料等)均已被证明是有效的能量受体。但是，基于上述材料构建的上转换纳米探针由于其发光强度低和相对较低的上转换效率而导致上转换探针在实际检测及分析中的灵敏度严重受限。

发明内容

本发明的目的主要是针对检测灵敏度较低的问题，提供一种基于上转换纳米材料与BHQ-1间构建荧光共振能量转移体系应用于检测HE4的方法。首先通过溶剂热法合成了聚丙烯酸修饰的上转换纳米粒子并作为能量供体，再通过酰胺化反应将末端氨基修饰有猝灭基团BHQ-1的适配体偶联至上转换纳米粒子的表面，并将其作为能量受体以构建具有共振能量转移特性的上转换纳米探针。最终，由于适配体对HE4的特异性识别作用，使适配体的构象发生改变，上转换纳米粒子和BHQ-1之间的距离增大，从而使荧光共振能量转移过程被抑制或阻断，能量供体本身的荧光恢复，因此实现HE4的高灵敏度定量分析检测。