[发明专利]一种食品病原菌副溶血弧菌快速检测的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种用于食品病原菌副溶血弧菌的快速检测的引物组及DNA片段，其特征在于，所述引物组包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的引物；所述DNA片段为SEQ IDNO：4所示的片段。

2.根据权利要求1所述的一种用于食品病原菌副溶血弧菌快速检测的引物组及DNA片段，其特征在于：所述引物组及DNA片段是通过化学合成的核苷酸片段。

3.一种权利要求1所述的用于食品病原菌副溶血弧菌快速检测的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1所述的引物组和DNA片段，PCR缓冲液，STE缓冲液。

4.根据权利要求3所述的一种用于食品病原菌副溶血弧菌快速检测的试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液包括5μl 10×Easy Taq Buffer，4μl 10mmol/L dNTPs，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl Taq酶，1.5μl基因组DNA，36.5μl ddH₂O。

5.根据权利要求3所述的一种用于食品病原菌副溶血弧菌快速检测的试剂盒，其特征在于：所述STE缓冲液是由0.584g的NaCl、0.12g的Tris和0.37g的EDTA溶解于100ml的双重蒸馏水配制而成的。

6.一种权利要求1-5任一项所述的食品病原菌副溶血弧菌快速检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，提取样品微生物基因组总DNA；

步骤2，分别以超纯水、化学合成的DNA片段及样品总DNA为模板进行PCR扩增，超纯水扩增产物作为待测样品的阴性对照，化学合成的DNA片段扩增产物作为待测样品的标准；样品PCR扩增产物作为DGGE检测的待测样品；

步骤3，对标准和待测样品进行DGGE检测；

步骤4，DGGE检测完毕后，将含有化学合成的DNA片段及待测样品的凝胶放入2.5×4SRed Plus染液中染色15分钟，拍照进行分析对比，当待测样品条带与标准条带在DGGE凝胶上处于同一水平位置时，说明待测样品为食品病原菌副溶血弧菌感染的样品；当待测样品没有条带或条带与标准条带在DGGE凝胶上不处于同一水平位置时，说明测样品没有感染食品病原菌副溶血弧菌。

7.根据权利要求6所述的一种食品病原菌副溶血弧菌快速检测的方法，其特征在于，所述步骤1中样品微生物基因组总DNA提取的步骤如下：

(1)用STE缓冲液浸泡样品后，过滤获得滤液；

(2)将滤液12000rpm离心2min以获得菌体，用STE缓冲液洗涤菌体，12000rpm离心2min；

(3)加入STE缓冲液350μl、溶菌酶30μl，吹洗混匀，在37℃下恒温水浴3.5h；

(4)加入SDS35μl、Proteinase K5μl，在55℃下恒温水浴2.5h，完成后取出，冷却至室温，加入NaCl70μl；

(5)加入450μl DNA提取酚试剂，混匀，12000rpm离心10min，取上清液；

(6)加入等体积的体积比为25：24：1的苯酚-氯仿-异戊醇抽提，离心，取上清液，重复一次；

(7)加入2倍体积的异丙醇使DNA沉淀，静置后弃掉上清液，取沉淀；

(8)用75％乙醇溶液洗涤沉淀，吹洗，静置2min后吸出乙醇；

(9)加入40μl的ddH₂O、2μl的RNA酶，在55℃下水浴30min，放入4℃恒温箱内保存过夜，待用。

8.根据权利要求6所述的一种食品病原菌副溶血弧菌快速检测的方法，其特征在于，所述步骤3中DEGG检测为：选择10％的聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％-60％，梯度混合制胶；电泳液温度上升至55℃时，先220V恒压预电泳5min，用50μL微量进样器快速上样，上样量为30μl；在55℃，85V条件下恒温恒压电泳8h。