[发明专利]一种HCV四受体转基因合并STAT1敲除小鼠的制备方法在审
| 申请号： | 202011565016.9 | 申请日： | 2020-12-25 |
| 公开（公告）号： | CN114686517A | 公开（公告）日： | 2022-07-01 |
| 发明（设计）人： | 杨威;林田莉;李端 | 申请（专利权）人： | 中国医学科学院病原生物学研究所 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/89;C12N15/90;C12N15/113;C12N15/12;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京天奇智新知识产权代理有限公司 11340 | 代理人： | 陆军 |
| 地址： | 100010*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 hcv 受体 转基因 合并 stat1 小鼠 制备 方法 | ||
1.一种CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因合并CRISPR/Cas9技术构建STAT1基因敲除小鼠的构建方法，其特征在于：
(1)CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因小鼠构建；
将pFUW-CSCO-4hEF表达质粒酶切；
得到线性化DNA片段显微注射入ICR小鼠受精卵，植入假孕小鼠子宫内；
子鼠出生后经基因组PCR方法鉴定基因型，获得阳性4hEFTg小鼠；
(2)STAT1敲除小鼠构建；
针对STAT1基因第一外显子和第二外显子序列，设计2对sgRNA序列，通过构建STAT1基因敲除载体并体外转录获得sgRNA；
合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSAⅠ线性化的pUC57-sgRNA载体，通过体外转录成为可注射的sgRNA；
pST1374-NLS-flag-linker-Cas9载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。
经显微注射入ICR小鼠受精卵；
受精卵移植入ICR假孕雌鼠子宫；
小鼠出生后经基因组PCR方法检测，得到阳性F0代小鼠；
F0代小鼠经自交获得纯合STAT1-/-小鼠；
(3)4hEFTg STAT1-/-小鼠构建；
将纯合STAT1-/-小鼠与4hEFTg小鼠杂交，出生小鼠经PCR检测，获得含CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因阳性STAT1杂合敲除的F1代4hEFTgSTAT1+/-小鼠；
F1代4hEFTg STAT1+/-小鼠自交，出生小鼠经PCR扩增测序检测，鉴定基因型，获得含CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因阳性合并STAT1纯合敲除的F2代4hEFTg STAT1-/-小鼠，即为小鼠动物模型。
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