[发明专利]一种HCV四受体转基因合并STAT1敲除小鼠的制备方法

说明书

本发明提供了一种CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因合并CRISPR/Cas9技术构建STAT1基因敲除小鼠(简称4hEF^Tg STAT1^‑/‑小鼠)的构建方法，根据转基因技术和显微注射法获得四受体转基因小鼠，基于CRISPER/Cas9系统设计靶基因sgRNA经显微注射法获得STAT1敲除小鼠；将四受体转基因小鼠与STAT1敲除小鼠杂交得到杂合F1代，再通过F1代自交获得纯合4hEF^Tg STAT1^‑/‑小鼠，即本发明小鼠，可用于建立慢性HCV感染小鼠模型。

技术领域

本发明涉及转基因和基因编辑技术领域，特别涉及一种CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因合并CRISPR/Cas9技术构建STAT1基因敲除小鼠(简称4hEF^Tg STAT1^-/-小鼠)的构建方法及应用。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)是经血液传播病毒，感染人类后易慢性化。病毒的持续存在可使肝炎向肝脂肪病变、肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌进展，严重威胁人类健康。在世界范围，据估计，2015年全球病毒性丙型肝炎的患病率为1.0％(95％的不确定区间为0.8-1.1)，有7100万(62.5-79.4)为慢性病毒性感染。目前尚无HCV疫苗，而疫苗研发难点除了HCV基因组差异大，不同基因型的病毒序列差异可高达50％{Bukh,1995#111}{Simmonds,2005#112}，在感染机体内常以准种形式存在外，目前缺乏合适的动物模型也限制了HCV疫苗的研发应用。

HCV自然宿主是人和黑猩猩，由于灵长类动物费用高和伦理问题复杂，限制了该类动物的应用。近几年，国内外学者已经在小型动物模型上进行各种尝试，已取得部分进展，主要有：

(1)树鼩模型：树鼩对HCV易感，一些动物在初次感染3年后疾病可进展成肝纤维化和肝硬化{Amako,2010#155}。但树鼩属于野生动物，遗传品系不稳定，应用受限。

(2)HCV基因转基因小鼠模型：可表达表达HCV基因单个蛋白组分产物或基因多个蛋白组合产物，但会由于表达HCV产物的不同、小鼠背景的差异性或HCV蛋白表达所用启动子不同而出现组织病理报告差异大，表现为不同程度的肝疾病，使针对发病机制研究时需要多加注意。

(3)异种移植小鼠模型：通过将人肝细胞(如肝癌细胞系或者原代肝细胞)移植入小鼠体内，形成人肝移植小鼠。该类小鼠模型免疫缺陷，不能用于研究宿主抗HCV的特异性适应性免疫反应和再现病毒整个生命周期。

(4)宿主因子人源化小鼠模型：在HCV感染人体过程中有四个(CD81、SCARB1、CLDN1和OCLN)入侵必需宿主因子，其中CD81第二个包外环关键氨基酸残基和OCLN分子是阻止HCV入侵啮齿动物细胞的原因。利用腺病毒瞬时表达人CD81单分子或同时表达人CD81、SCARB1、OCLN和CLDN1四种分子的小鼠模型却并未成功建立HCV感染{Masciopinto,2002#191}{Hikosaka,2011#192}。在近交鼠上同时稳定表达人CD81和OCLN分子能使HCV成功入侵，但小鼠的免疫系统限制了HCV的感染{Dorner,2011#194}，在此基础上敲除STAT1-/-，该小鼠能成功建立HCV感染，并能激活适应性免疫反应。

发明内容

本发明为解决现有丙型肝炎病毒感染小鼠模型缺乏，目的在于提供了一种构建CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因合并STAT1基因敲除小鼠的制备方法。

本发明另一目的在于通过本发明方法制备的动物模型用于HCV疫苗探索研究的模型基础。

本发明采用的技术方案包括以下具体步骤：

(1)将人CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体基因合成后，插入同一pFUW-CSCO载体核酸内切酶NdeI酶切位点，获得pFUW-CSCO-4hEF表达载体。