[发明专利]一种D-N-氨甲酰水解酶在D-色氨酸生产上的应用

说明书

本发明涉及D‑N‑氨甲酰水解酶及其在D‑色氨酸生产上的应用，所述水解酶具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列。

技术领域

本发明属于生物催化领域，具体涉及一种D-N-氨甲酰水解酶及其在D-色氨酸生产上的应用。

背景技术

D-色氨酸(D-Trp)是一种手性非常见氨基酸，在饲料行业和医药行业都有很大的市场和应用价值。在食品饲料工业中，D-色氨酸可以作为一种非营养甜味剂或饲料添加剂；在医药行业中，D-色氨酸主要被作为合成一些医药(如他达拉非)的中间体，或半合成肽类抗生素的原料；此外，D-色氨酸具有较高稳定性、广谱抗菌性、毒性小、过敏性低、吸收快、血浓度高、药力持续时间长等优势，是一种有低过敏性和抗药性的优点的非蛋白活性的氨基酸。因此D-色氨酸有很大的市场前景，需求量呈逐年增加的趋势。

目前，D-色氨酸的合成方法有拆分法、酶法合成和不对称合成法等。化学拆分法所用的拆分剂较贵，且具有步骤多、污染环境等问题；酶法拆分则在获得D-构型的同时分离(或消耗掉)一半L-构型；化学的不对称合成法步骤多、收率低、有机试剂容易污染环境；而酶法合成工艺简单、专一性强，条件温和且不污染环境，符合大规模工业化生产的要求。

当前酶法合成D-色氨酸的主要考虑路线是以L-吲哚甲基海因作为原料，使用海因消旋酶、D-海因酶和D-N-氨甲酰水解酶组成的三酶催化反应。一方面由于L-色氨酸的发酵生产已经成为成本较低的色氨酸骨架的主要来源，另一方面，该路线反应得率高,与其他方式相比具有较好的经济优势。

在L-吲哚甲基海因路线中，D-N-氨甲酰水解酶催化D-N-氨甲酰氨基酸水解得到产品D-氨基酸，它的立体选择性和催化速度是决定产物浓度和反应时间的主要因素。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种来源于红细菌Amaricoccussolimangrovi HB172011的酶蛋白，本发明发现，该酶蛋白可以高的立体选择性和催化速度催化D-N-氨甲酰氨基酸水解得到产品D-氨基酸。该酶蛋白是一种高效的D-N-氨甲酰水解酶，所述D-N-氨甲酰水解酶具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列：

所述D-N-氨甲酰水解酶具有快速水解D-N-氨甲酰-色氨酸生成D-色氨酸和碳酸氢铵的功能；

另一方面，本发明提供编码本发明所述的D-N-氨甲酰水解酶的多核苷酸，以及包含本发明的多核苷酸的载体(例如常用的大肠杆菌表达载体：pETDuet Vectors(Novagen)、pGEX Vectors(GE Healthcare)或pCold Vectors(Takara Bio))，所述多核苷酸具有如SEQ ID No.2所述的核苷酸序列:

另一方面，本发明提供包含本发明所述的D-N-氨甲酰水解酶、所述的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体的宿主细胞。

另一方面，本发明还提供一种制备D-色氨酸的方法，其特征在于，以D-N-氨甲酰色氨酸为原料，加入所述D-N-氨甲酰水解酶或所述的宿主细胞制得D-色氨酸。

另一方面，本发明还提供一种制备D-色氨酸的方法，其特征在于，以L-吲哚甲基海因作为原料，加入海因消旋酶、D-海因酶和所述D-N-氨甲酰水解酶或者加入海因消旋酶、D-海因酶和所述的宿主细胞，制得D-色氨酸。

本发明的D-N-氨甲酰水解酶可作为催化剂应用于海因酶过程制备光学纯D-色氨酸，其可溶性好，催化效率高、立体选择性强。

附图说明

图1为SEQ ID No.1编码的蛋白在大肠杆菌中的表达情况的SDS-PAGE胶图，其中：

1：表达了水解酶的裂解液上清；

2：表达了水解酶的裂解后非水溶部分。