[发明专利]一种分枝杆菌的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体和工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种分枝杆菌的17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体和工程菌及其应用，属于遗传工程和发酵工程领域。本发明将分枝杆菌(Mcobacterium sp.)LY‑1的17β‑羟基类固醇脱氢酶17β‑HSDy的L173位点突变成了缬氨酸，得到突变体17β‑HSDy2，并将此突变体进行外源表达，重组菌B.Subtilis‑pMA5‑17β‑HSDy2的比酶活达到6882.45U·mg^‑1，酶活提高16.4％。本发明还提供了突变体17β‑HSDy2的增强表达菌株，以pMV261为增强表达质粒，实现了突变体17β‑HSDy2在分枝杆菌LY‑1中的增强表达，相较于原始菌株显著的降低了9α‑羟基雄甾烯‑4‑烯‑3，17‑二酮的积累，提高了睾酮积累。该增强表达菌株还可用于雄甾烯‑4‑烯‑3，17‑二酮转化睾酮的生产，具有潜在工业应用。

技术领域

本发明属于遗传工程和发酵工程领域，具体涉及一种来源于分枝杆菌的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体和重组菌及其应用，能将植物甾醇转化为睾酮以及将雄甾烯-4-烯-3，17-二酮转化为睾酮。

背景技术

17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD)，是一类氧化还原酶，能够催化甾体中C-17的羟基与酮基之间的相互转化，反应时需要辅因子NAD(P)H/NAD(P)⁺。在生物进化的过程中，始终存在17β-HSD的表达，17β-HSD家族中酶的结构与功能也随着微生物到脊柱动物的进化而不断的分化。Marcus等人于Comamonas testosterone中发现的17β-HSD能特异性地催化从雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)到睾酮(T)的转化。而在某些嗜热酵母中17β-HSD不仅能催化AD到T，还能实现雌酮与雌二醇之间的相互转化。

早期的免疫组织实验证明17β-HSD在各种鸟类、爬行类动物和哺乳类动物中均有分布。到目前为止，高等动物中的17β-HSD酶研究较多，例如在人类的机体中，17β-HSD酶在雌激素的合成中起至关重要的作用，负责T等性激素类甾体化合物转化的17β-HSD主要分布在胎盘、卵巢、睾丸间质细胞等组织中，其中17β-HSD3仅在人类的睾丸间质细胞中得到克隆，作为睾丸间质细胞组织的一种标志酶，它同样具有催化AD到T的能力。

AD是一类较为常见的具有雄激素功能的甾醇代谢产物，一般为白色粉末，水中的溶解度低，易溶于乙酸乙酯、乙醇等有机试剂。其生物活性介于DHEA和T之间，常用作部分雄激素的合成。T是睾丸内间质细胞产生的一类雄性激素，其分子式为C₁₉H₂₆O₂，微黄色粉末，不溶于水，然而易溶于有机试剂。因此常作为雄性激素类药物，具有较强的雄激素特性，在临床方面具有广泛的应用。

因此寻找新的合适的具有高催化活性的17β-羟基类固醇脱氢酶有利于促进在生物医药领域转化甾醇的应用。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一株17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的工程菌株，提供该突变体的基因及包含该突变体基因的重组质粒及包含该重组质粒的宿主细胞，实现了17β-羟基类固醇脱氢酶的增强表达，相应的突变体进行异源表达并且能够有效转化植物甾醇实现产物组成结构的调整。该增强表达工程菌株的发酵结果显示：显著的降低了9α-羟基雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(9α-OH-AD)的积累，提高了雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(AD)和睾酮(T)的积累。

本发明的技术方案是：

该分枝杆菌LY-1是从自然界中土样中经分离筛选获得的一株放线菌，该菌于2016年9月22日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13031,分类命名为分枝杆菌(Mcobacterium sp.)LY-1。