[发明专利]具有RUVC结构域的酶

说明书

本公开提供具有区别性结构域特征的核酸内切酶，以及使用此类酶或其变体的方法。

交叉引用

本申请要求2019年2月14日提交的题为“MG6 ENZYMES WITH RUVC DOMAINS”的美国临时申请号62/805,893的权益，将其通过引用完整并入本文。

背景技术

Cas酶及其相关的成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)指导核糖核酸(RNA)似乎是原核免疫系统的普遍(约45％的细菌，约84％的古细菌)组分，用于保护此类微生物通过CRISPR-RNA指导的核酸切割来对抗非自身核酸，例如传染性病毒和质粒。虽然编码CRISPRRNA元件的脱氧核糖核酸(DNA)元件在结构和长度上可以相对保守，但它们的CRISPR相关(Cas)蛋白高度多样化，包含广泛多种核酸相互作用结构域。虽然早在1987年就已观察到CRISPR DNA元件，但CRISPR/Cas复合物的可编程核酸内切酶切割能力直到最近才被认识到，导致在各种DNA操作和基因编辑应用中使用重组CRISPR/Cas系统。

序列表

本申请包含序列表，所述序列表已以ASCII格式电子提交，并通过引用整体并入本文。创建于2020年2月14日的所述ASCII副本被命名为55921-708_601_SL.txt，并且大小是786KB。

发明内容

在一些方面，本公开提供了工程改造的核酸酶系统，其包含：(a)包含RuvC_III结构域和HNH结构域的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶源自未培养的微生物，并且其中所述核酸内切酶是2类II型Cas核酸内切酶；以及(b)工程改造的指导核糖核酸结构，其被构造成与所述核酸内切酶形成复合物，所述复合物包含：(i)指导核糖核酸序列，其被构造成与靶脱氧核糖核酸序列杂交；(ii)tracr核糖核酸序列，其被构造成与所述核酸内切酶结合。在一些实施方案中，RuvC_III结构域包含与SEQ ID NO:45-88或SEQ ID NO:246-262中任一个具有至少70％、至少75％、至少80％或至少90％序列同一性的序列。在一些方面，本公开提供了工程改造的核酸酶系统，其包含：(a)包含与SEQ ID NO:45-88或SEQ ID NO:246-262中任一个具有至少75％序列同一性的RuvC_III结构域的核酸内切酶；以及(b)工程改造的指导核糖核酸结构，其被构造成与所述核酸内切酶形成复合物，所述复合物包含：(i)指导核糖核酸序列，其被构造成与靶脱氧核糖核酸序列杂交；(ii)tracr核糖核酸序列，其被构造成与所述核酸内切酶结合。在一些方面，本公开提供了工程改造的核酸酶系统，其包含：(a)被构造成与包含SEQ ID NO:149-158的前间区序列邻近基序(protospacer adjacentmotif，PAM)序列结合的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶是2类II型Cas核酸内切酶；以及(b)工程改造的指导核糖核酸结构，其被构造成与所述核酸内切酶形成复合物，所述复合物包含：(i)指导核糖核酸序列，其被构造成与靶脱氧核糖核酸序列杂交；(ii)tracr核糖核酸序列，其被构造成与所述核酸内切酶结合。在一些实施方案中，核酸内切酶不是Cas9核酸内切酶、Cas14核酸内切酶、Cas12a核酸内切酶、Cas12b核酸内切酶、Cas 12c核酸内切酶、Cas12d核酸内切酶、Cas12e核酸内切酶、Cas13a核酸内切酶、Cas13b核酸内切酶、Cas13c核酸内切酶或Cas 13d核酸内切酶。在一些实施方案中，核酸内切酶与Cas9核酸内切酶具有小于80％同一性。在一些实施方案中，核酸内切酶进一步包含HNH结构域。在一些实施方案中，tracr核糖核酸序列包含与选自SEQ ID NO:138-148或SEQ ID NO:280中任一个的约60至90个连续核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。在一些方面，本公开提供了工程改造的核酸酶系统，其包含，(a)工程改造的指导核糖核酸结构，其包含：指导核糖核酸序列，其被构造成与靶脱氧核糖核酸序列杂交；和tracr核糖核酸序列，其被构造成与核酸内切酶结合，其中所述tracr核糖核酸序列包含与选自SEQ ID NO:138-148或SEQ ID NO:280中任一个的约60至90个连续核苷酸具有至少80％序列同一性的序列；以及(b)2类II型Cas核酸内切酶，其被构造成与工程改造的指导核糖核酸结合。在一些实施方案中，核酸内切酶被构造成与选自包含SEQ ID NO:149-158的组的前间区序列邻近基序(PAM)序列结合。在一些实施方案中，工程改造的指导核糖核酸结构包含至少两个核糖核酸多核苷酸。在一些实施方案中，工程改造的指导核糖核酸结构包含一个包含指导核糖核酸序列和tracr核糖核酸序列的核糖核酸多核苷酸。在一些实施方案中，指导核糖核酸序列与原核、细菌、真核、真菌、植物、哺乳动物或人基因组序列互补。在一些实施方案中，指导核糖核酸序列的长度为15-23个核苷酸。在一些实施方案中，核酸内切酶包含一个或多个核定位序列(NLS)，其在核酸内切酶的N末端或C末端的近端。在一些实施方案中，NLS包含选自SEQ ID NO:180-195的序列。在一些实施方案中，工程改造的核酸酶系统进一步包含单链或双链DNA修复模板，其从5’至3’包含：包含靶脱氧核糖核酸序列5’的至少20个核苷酸的序列的第一同源臂，至少10个核苷酸的合成DNA序列，以及包含靶序列3’的至少20个核苷酸的序列的第二同源臂。在一些实施方案中，第一同源臂或第二同源臂包含至少40、80、120、150、200、300、500或1,000个核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述系统进一步包含Mg²⁺源。在一些实施方案中，核酸内切酶和tracr核糖核酸序列源自同一门内的不同细菌物种。在一些实施方案中，核酸内切酶源自属于皮杆菌属(Dermabacter)的细菌。在一些实施方案中，核酸内切酶源自属于疣微菌门(Phylum Verrucomicrobia)、暂定异域菌门(Phylum Candidatus Peregrinibacteria)或暂定黑水仙菌门(Phylum Candidatus Melainabacteria)的细菌。在一些实施方案中，HNH结构域包含与SEQ ID NO:89-132或SEQ ID NO:263-279中任一个具有至少70％或至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，核酸内切酶包含SEQ ID NO:1-44或SEQ ID NO:229-245或与其具有至少55％同一性的变体。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与选自SEQ IDNO:46或SEQ ID NO:46-47的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与选自SEQ ID NO:90或SEQ ID NO:90-91的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，核酸内切酶包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个选自SEQ ID NO:214-221的肽基序。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与选自SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:2-3的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，指导RNA结构包含与选自SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:133的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，指导RNA结构包含含有发夹的tracr核糖核酸序列，所述发夹包含至少8个、至少10个或至少12个碱基配对的核糖核苷酸。在一些实施方案中，核酸内切酶被构造成与包含选自SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:154的序列的PAM结合。在一些实施方案中：(a)核酸内切酶包含与SEQ ID NO:46至少70％、80％或90％相同的序列；(b)指导RNA结构包含与SEQ ID NO:133或SEQ ID NO:138至少70％、80％或90％相同的序列；(c)核酸内切酶被构造成与包含SEQ ID NO:149或SEQ ID NO:154的PAM结合。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与选自SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:48-71的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与选自SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:92-115的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，核酸内切酶包含SEQ ID NO:222。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与选自SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4-27的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，指导RNA结构包含与选自SEQ ID NO:139、SEQ IDNO:139-143或SEQ ID NO:134的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，核酸内切酶被构造成与包含SEQ ID NO:150或SEQ ID NO:155的PAM结合。在一些实施方案中：(a)核酸内切酶包含与SEQ ID NO:48至少70％、80％或90％相同的序列；(b)指导RNA结构包含与SEQ ID NO:134或SEQ ID NO:139至少70％、80％或90％相同的序列；以及(c)核酸内切酶被构造成与包含SEQ ID NO:150或SEQ ID NO:155的PAM结合。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与选自SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:72-83和SEQ ID NO:246-253的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与选自SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:116-127和SEQ ID NO:263-270的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，核酸内切酶包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个选自SEQ IDNO:223-225的肽基序。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与选自SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:28-39和SEQ ID NO:229-236的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，指导RNA结构包含与选自SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:144-146和SEQ ID NO:135的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，核酸内切酶被构造成与包含选自SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:156的序列的PAM结合。在一些实施方案中：(a)核酸内切酶包含与SEQ ID NO:72至少70％、80％或90％相同的序列；(b)指导RNA结构包含与SEQ ID NO:135或SEQ ID NO:144至少70％、80％或90％相同的序列；以及(c)核酸内切酶被构造成与包含SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:156的PAM结合。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与选自SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:84-86和SEQ ID NO:254-262的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与选自SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:128-130和SEQ ID NO:271-279的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与选自SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:40-42和SEQ ID NO:237-245的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，指导RNA结构包含与选自SEQ ID NO:147、SEQID NO:280或SEQ ID NO:136的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，核酸内切酶被构造成与包含选自SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:157的序列的PAM结合。在一些实施方案中：(a)核酸内切酶包含与SEQ ID NO:84至少70％、80％或90％相同的序列；(b)指导RNA结构包含与SEQ ID NO:136或SEQ ID NO:147至少70％、80％或90％相同的序列；以及(c)核酸内切酶被构造成与包含SEQ ID NO:152或SEQ ID NO:157的PAM结合。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与选自SEQ ID NO:87或SEQ ID NO:87-88的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与选自SEQ ID NO:131或SEQ ID NO:131-132的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，核酸内切酶包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个选自SEQ ID NO:226-228的肽基序。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与选自SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:43-44的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，指导RNA结构包含含有至少两个发夹的tracr核糖核酸序列，所述发夹包含少于5个碱基配对的核糖核苷酸。在一些实施方案中，指导RNA结构包含与选自SEQ ID NO:148或SEQ ID NO:137的序列至少70％、80％或90％相同的序列。在一些实施方案中，核酸内切酶被构造成与包含选自SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:158的序列的PAM结合。在一些实施方案中：(a)核酸内切酶包含与SEQ ID NO:87至少70％、80％或90％相同的序列；(b)指导RNA结构包含与SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:148至少70％、80％或90％相同的序列；以及(c)核酸内切酶被构造成与包含SEQ ID NO:153或SEQ ID NO:158的PAM结合。在一些实施方案中，序列同一性由BLASTP、CLUSTALW、MUSCLE、MAFFT或Smith-Waterman同源性搜索算法确定。在一些实施方案中，序列同一性通过BLASTP同源性搜索算法(其使用3的字长(W)、10的期望(E)的参数和BLOSUM62评分矩阵(设置缺口(存在时)罚分为11，延伸为1)并使用条件型组成得分矩阵调整)来确定。