[发明专利]稳定的靶向整合

权利要求书

1.一种用于将至少一种外源序列稳定整合到细胞的基因组DNA内的方法，所述方法包括将至少一种外源序列整合到选自NCBI参考序列NW_003613934.1、NW_003614159.1、NW_003613732.1或其同源物的基因组序列内的位点内。

2.权利要求1的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

3.权利要求1或2的方法，其中所述至少一种外源序列编码蛋白质或RNA分子。

4.权利要求3的方法，其中所述蛋白质是治疗蛋白质、重组蛋白质或工业蛋白质。

5. 权利要求3的方法，其中所述RNA分子是小干扰RNA ()、微小RNA (miRNA)、引导RNA(gRNA)或其前体。

6.权利要求3至5中任一项的方法，其中所述至少一种外源序列与启动子控制序列可操作地连接。

7.权利要求3至6中任一项的方法，其中所述外源序列的表达是稳定、可预测和可重现的。

8.权利要求1或2的方法，其中所述至少一种外源序列包含多核苷酸修饰酶的至少一种识别序列。

9.权利要求8的方法，其中所述至少一种识别序列包含并不内源地存在于哺乳动物细胞的基因组中的核酸序列。

10.权利要求8的方法，其中所述多核苷酸修饰酶是位点特异性重组酶或靶向核酸内切酶。

11. 权利要求10的方法，其中所述位点特异性重组酶是Bxb1整合酶、Cre重组酶、FLP重组酶、γδ解离酶、λ整合酶、phi C31整合酶、R4整合酶、Tn3解离酶或TP901-1重组酶。

12. 权利要求10的方法，其中所述靶向核酸内切酶是锌指核酸酶(ZFN)、成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关(Cas) (CRISPR/Cas)核酸酶系统、CRISPR/Cas双切口酶系统、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、或包含可编程DNA结合结构域和核酸酶结构域的融合蛋白。

13. 一种用于制备包含整合到基因组DNA内的外源序列的细胞的方法，所述方法包括：

a)将以下引入细胞内：(i)靶向核酸内切酶或编码靶向核酸内切酶的核酸，所述靶向核酸内切酶靶向选自NCBI参考序列NW_003613934.1、NW_003614159.1、NW_003613732.1或其同源物的基因组序列内的靶位点，以及(ii)包含外源序列的供体多核苷酸；和

b)将所述细胞维持在使得所述外源序列整合到基因组序列的靶位点内的条件下。

14.权利要求13的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

15.权利要求13或14的方法，其中所述供体多核苷酸中的外源序列的侧翼为与基因组序列中侧接靶位点的序列具有实质序列同一性的序列。

16.权利要求15的方法，其中所述外源序列通过同源性指导的过程整合到基因组内。

17.权利要求13或14的方法，其中所述供体多核苷酸中的外源序列的侧翼为由至少一种靶向核酸内切酶识别的序列。

18.权利要求17的方法，其中所述外源序列通过直接连接过程整合到基因组内。