[发明专利]稳定的靶向整合

说明书

用于将外源序列整合到基因组基因座中的方法，其中所述整合是稳定的并且所述外源序列可以可预测地且可靠地发挥功能。

相关申请

本申请要求申请日为2019年4月18日的美国临时专利申请号62/835,810的优先权利益，所述美国临时专利申请的全部内容整体引入本文。

技术领域

本公开内容涉及将外源序列稳定整合到基因组基因座内，其中所述外源序列可以可预测地且可靠地发挥功能。

背景技术

传统的细胞系改造方法已使用方法将转基因随机插入宿主细胞的基因组内。此类改造方法已导致用于重组治疗蛋白质表达的高生产力细胞系的开发。然而，此类整合方法已导致不稳定的细胞系和克隆群体，其在表达水平和蛋白质异质性方面对于相同分子的表达明显不同。为了避免这些问题，对于重组治疗蛋白质表达期望转基因的位点特异性靶向整合。

成功的转基因的位点特异性靶向整合的关键取决于用于靶向以整合的合适的基因组定位(即“安全港”)。该定位必须顺应转基因或外源序列插入，允许转基因的可预测和稳定表达，并且不得干扰细胞生长和功能。对于人衍生的细胞系已鉴定了在AAVS1基因座处的合适位点，但尚未鉴定用于治疗蛋白质生产的许多细胞中的可行位点。因此，需要在中国仓鼠卵巢(CHO)和其它细胞中鉴定且验证合适的基因组定位，用于治疗蛋白质盒或其它外源序列的成功整合。

图1A显示了用于热点(hot spot)鉴定和验证方法1中的RMCE相容盒。

图1B显示了用于热点鉴定和验证方法2中的RMCE相容盒。

图2显示了与细胞表面结合的IgG的流式细胞术分析。左：具有GFP着陆垫(landingpad)的D145克隆。中：IgG有效载荷(payload)的随机整合。右：IgG有效载荷使用Cre重组酶的靶向整合。

图3显示了含有靶向整合产物的池而不是随机整合池中的阳性连接PCR。

图4显示了在MP 7 TI位点处的ZFN靶和展示阳性ZFN切割活性的CelI测定。

图5显示了在MP 58 TI位点处的ZFN靶和展示阳性ZFN切割活性的CelI测定。

图6显示了来自MP 58 TI位点的单克隆抗体产生。

在本公开内容的各个方面中，提供了用于将至少一种外源序列稳定整合到细胞的基因组DNA内的方法。该方法包括将至少一种外源序列整合到选自NCBI参考序列NW_003613934.1、NW_003614159.1、NW_003613732.1或其同源物的基因组序列内的位点内。

本公开内容的另一个方面包括用于制备包含整合到基因组DNA内的外源序列的细胞的方法。该方法包括(a)将以下引入细胞内：(i)靶向核酸内切酶或编码靶向核酸内切酶的核酸，其中所述靶向核酸内切酶靶向选自NCBI参考序列NW_003613934.1、NW_003614159.1、NW_003613732.1或其同源物的基因组序列内的靶位点，以及(ii)包含外源序列的供体多核苷酸；并且(b)将细胞维持在使得外源序列整合到基因组序列的靶位点内的条件下。

一些实施方案提供了宿主细胞，优选宿主细胞系，其包含整合到基因组DNA中的适合于稳定整合的至少一个预定靶位点内的至少一种外源序列。合适的预定靶位点优选位于选自NCBI参考序列NW_003613934.1、NW_003614159.1、NW_003613732.1或其同源物的基因组序列内。

下文更详细地描述本公开内容的其它方面和重述。

具体实施方式