[发明专利]控制microRNA表达的方法

说明书

公开了在宿主细胞中从初级microRNA(pri‑miRNA)产生单切割前体microRNA(pre‑miRNA)的方法。还公开了在宿主细胞中从初级microRNA(pri‑miRNA)增加单切割前体microRNA(pre‑miRNA)的产生水平并减少双切割前体microRNA(pre‑miRNA)的产生水平的方法；在宿主细胞中从初级microRNA(pri‑miRNA)减少单切割前体microRNA(pre‑miRNA)的产生水平并增加双切割前体microRNA(pre‑miRNA)的产生的方法；调节宿主细胞中microRNA(miRNA)表达水平的方法；调节受试者中microRNA(miRNA)表达水平的方法；治疗受试者的疾病的方法。本文还公开了遗传修饰的初级microRNA(pri‑miRNA)。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年8月2日提交的美国专利申请号62/922,198的优先权，其全部内容被出于所有目的通过引用并入本文。

技术领域

本发明大体上涉及分子生物学。特别地，本发明涉及控制microRNA加工和表达的方法。

发明背景

microRNA(miRNA)在基因调控中起重要作用，且参与许多重要的细胞过程。许多与miRNA畸变相关的疾病例证了它们的重要性。因此，尤其是在病变细胞中，必须控制miRNA在细胞中的表达水平，以恢复正常的miRNA表达水平。

传统的基因编辑方法包括通过敲除(knocking-out)或敲低(knocking-down)靶miRNA序列来调节microRNA(miRNA)在细胞中的表达。然而，这些方法包含固有的缺点，如产生非预期的miRNA序列、脱靶基因表达，以及难以控制miRNA表达水平。此外，使用常规方法提高miRNA表达水平也是不可能的。

鉴于上述情况，需要提供解决上述一些问题的替代方法。

概述

在一方面，提供了在宿主细胞中从包括以下结构的初级microRNA(pri-miRNA)产生单切割前体microRNA(pre-miRNA)的方法：

其中[B]至[b]以5’至3’方向形成茎环结构，并且

其中：

基序[B]和[b]各自构成茎区域中的切割位点；

基序[C]构成环区域；

该方法包括：

在基序[B]上游和/或基序[b]下游的区域中引入一个或更多个突变，以产生包含以下结构的遗传修饰的初级microRNA(pri-miRNA)：

其中基序[A]和[a]构成茎区域中的不对称内环(AIL)区域；

a)将来自步骤b)的遗传修饰的初级microRNA(pri-miRNA)转染至宿主细胞；

其中单切割前体microRNA(pre-miRNA)是通过在基序[B]处切割产生的。

在另一方面，提供了在宿主细胞中从包括以下结构的初级microRNA(pri-miRNA)产生单切割前体microRNA(pre-miRNA)的方法：

其中[A]至[a]以5’至3’方向形成茎环结构，并且

其中：

基序[A]和[a]构成茎区域中的不对称内环(AIL)区域；

基序[B]和[b]各自构成茎区域中的切割位点；