[发明专利]用于帕金森氏病的自体细胞替代疗法

权利要求书

1.生成中脑多巴胺能祖细胞(mDAP)群体的方法，所述方法包括：

提供诱导多能干细胞(iPSC)群体，优选人iPSC；

在生物基质水凝胶支持物中以每个区域约5,000-20,000个细胞，优选约10,000个细胞的密度将所述细胞群体铺板于离散的、单独的区域中，所述区域之间有足够的距离以保持所述区域之间的分离；以及

将所述细胞保持在足以将所述iPSC分化成mDAP的条件下。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物基质水凝胶支持物是基底膜提取物或合成基质。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在铺板之前将所述细胞悬浮在所述凝胶中。

4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述区域的直径为约2-10mm。

5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述区域之间的所述距离为1-3cm。

6.根据权利要求1至5所述的方法，其中所述iPSC表达碱性磷酸酶(AP)和TRA-1-60。

7.根据权利要求1至6所述的方法，其中所述mDAP表达一种、两种或更多种标志物，其包含FOXA2、OTX2、LMX1A和/或EN1，优选至少FOXA2和LMX1A；任选地，其中所述mDAPS是共表达FOXA2、LMX1A和NURR1的TH+细胞。

8.根据权利要求1至7所述的方法，其中所述iPSC通过以下方法生成，所述方法包括：

从受试者获得原代细胞群体，优选地，其中所述原代细胞是成纤维细胞、毛发角质形成细胞、血细胞或骨髓间充质干细胞(MSC)；

诱导所述细胞中OCT4、KLF4、SOX2和L-MYC的表达；以及

将所述细胞保持在足以将所述原代细胞变成iPSC的条件下。

9.根据权利要求8所述的方法，其中诱导OCT4、KLF4、SOX2和L-MYC的表达包括用多顺反子附件体载体转染所述原代细胞，所述多顺反子附件体载体包含与口蹄病病毒2A序列连接的人Oct4(OCT4-F2A)、KLF4、与猪捷申病毒2A序列连接的SOX2(SOX2-P2A)和L-MYC编码序列。

10.根据权利要求1至9所述的方法，其中所述iPSC通过以下方法来生成，所述方法包括：在所述细胞中表达一种或多种选自下组的外源性微小RNA(miRNA)，所述组由以下各项组成：miR-106a、-106b、-136s、-200c、-302s、-369s和-371/373。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述miRNA包含miR-302s和miR-200c中的一种或两种。

12.根据权利要求11所述的方法，其包括将包含编码miR-302s和miR-200c的序列的附件体载体引入到所述细胞中。

13.根据权利要求1至12所述的方法，其中所述iPSC通过以下方法来生成，所述方法包括：在所述原代细胞中表达OCT4、KLF4、SOX2、miR-302s和miR-200c中的全部。

14.根据权利要求13所述的方法，其包括对所述细胞引入：(i)载体，优选病毒载体或多顺反子附件体载体，其包含与口蹄病病毒2A序列连接的人Oct4(OCT4-F2A)、KLF4、与猪捷申病毒2A序列连接的SOX2(SOX2-P2A)和L-MYC编码序列，或Oct4、KLF4、SOX2和L-MYC的成熟RNA，或相应的蛋白质；以及(ii)载体，优选病毒载体或附件体载体，其包含编码miR-302s和miR-200c或成熟miR-302s和miR-200c的序列。