[发明专利]在生物反应器中悬浮扩增干细胞

权利要求书

1.一种在生物反应器中以悬浮培养扩增多能干细胞(PSC)的方法，所述方法包括

(i)向在所述生物反应器中悬浮培养的多能干细胞中添加ROCK抑制剂(ROCKi)；

(ii)加入细胞解离剂，从而解离所述多能干细胞的聚集体；

(iii)通过加入过量体积的培养基来稀释步骤(ii)中加入的细胞解离剂，所述过量体积的培养基足以将细胞解离剂的浓度降低至可以再次形成细胞聚集体的浓度；以及

(iv)在允许PSC扩增的合适条件下培养步骤(iii)中获得的混合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞解离剂为螯合剂，优选地所述螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、聚天冬氨酸、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、柠檬酸盐、柠檬酸、1,2-双(邻-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)和它们的组合。

3.根据权利要求2所述的方法，其中细胞解离剂为EDTA。

4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(ii)中EDTA的终浓度为至少100μM EDTA，在约100至约1000μM EDTA的范围内，在约250至约750μM EDTA的范围内，在约400至约600μMEDTA的范围内，或为约500μM EDTA，优选地为约500μM EDTA。

5.根据权利要求3或4中任一项所述的方法，其中在加入过量体积的培养基后，步骤(iii)中EDTA的浓度为约100μM或更低、约95μM或更低、约90μM或更低、约80μM或更低、约70μM或更低、在约100至约1μM EDTA的范围内或在约90至约1μM EDTA的范围内。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过量体积超过所述细胞解离剂的体积至少5倍。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，(iii)中的所述培养基包含ROCKi。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：

(v)将所述培养基更换为基本上不含ROCKi的培养基。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(iv)进行约1至约3天，优选地进行约2天。

10.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(v)在步骤(iii)之后约1至约3天，优选地约2天开始。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ROCKi选自AS1892802、盐酸法舒地尔、GSK 269962、GSK 429286、H 1152、HA 1100、OXA 06、RKI 1447、SB 772077B、SR 3677、TC-S 7001、thiazovivin、Y27632和它们的组合。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ROCKi为Y27632。

13.根据权利要求12所述的方法，其中将Y27632添加至约10μM的终浓度。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之前约2至约4小时向步骤(i)中加入所述ROCKi。