[发明专利]在生物反应器中悬浮扩增干细胞

说明书

本发明涉及一种在生物反应器中以悬浮培养扩增多能干细胞(PSC)的方法，所述方法包括(i)向在所述生物反应器中悬浮培养的多能干细胞中添加ROCK抑制剂(ROCKi)；(ii)加入细胞解离剂，从而解离所述多能干细胞的聚集体；(iii)通过加入过量体积的培养基来稀释步骤(ii)中加入的细胞解离剂，所述过量体积的培养基足以将细胞解离剂的浓度降低至可以再次形成细胞聚集体的浓度；以及(iv)在允许PSC扩增的合适条件下培养步骤(iii)中获得的混合物。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年12月11日提交的欧洲专利申请No.19 215 091.0的优先权的权益，将其内容通过引用整体并入本文以用于所有目的。

技术领域

本发明涉及一种在生物反应器中以悬浮培养扩增多能干细胞(PSC)的方法。

背景技术

多能干细胞(PSC)是贴壁细胞，因此通常在诸如烧瓶的细胞培养容器中培养，在烧瓶中多能干细胞黏附在容器的底部。为了促进黏附，通常用细胞外基质(ECM)的蛋白质涂覆容器的底部。然而，这种细胞培养方法不能用于生产临床应用中所需的大量PSC，因为在细胞培养瓶中培养是耗时、劳动密集的并且需要大量材料(培养基和塑料器皿)。已经描述了将搅拌罐生物反应器中的悬浮培养作为贴壁培养的替代。对此，PSC并非在细胞培养容器底部的单细胞层中生长，而是形成聚集体，在该聚集体中细胞彼此附着。因此，在悬浮培养中不需要补充ECM蛋白以允许形成细胞聚集体。悬浮培养被看作是更有效的，因为还可以控制培养条件以获得更高的细胞数量且需要更少的材料和时间。

然而，在悬浮培养中PSC的连续增殖导致聚集体尺寸的连续增加。超过一定的聚集体直径，无法向聚集体内的细胞充分地提供营养物和/或生长因子或其它信号分子，于是这些细胞自发地分化或凋亡。为了连续扩增PSC，因此必须将聚集体解离，并且必须对所得单细胞再接种(“传代”)。然而，悬浮培养中的传代造成了几个问题：聚集体的解离可能导致PSC的生存力降低或导致自发分化，因为这些对外部影响敏感。此外，当存在大量细胞时，难以在封闭系统中使该步骤自动化，因为必须快速自聚集体中分离细胞培养基。

最常用于聚集体解离的方法是酶消化。对此，使PSC的黏附分子蛋白水解性地切割。由此，细胞彼此分离。已经描述了酶或包含酶的溶液，包括Accutase、Accumax、胰蛋白酶、TrypLE Select和胶原酶B。必须终止酶反应以防止过度消化，过度消化将再次导致裂解或细胞凋亡。通常通过强稀释或加入随后通过离心移除的终止试剂来实现酶反应(reagent)的终止。此外，酶消化影响PSC的增殖和聚集体形成，因为在此过程中膜结合的黏附分子被移除，其必须再次形成。此外，PSC通常彼此完全分离，这可能对其多能性和生存力产生负面影响。

在本领域中还描述了细胞聚集体的机械解离。对此，例如迫使聚集体通过具有允许较小聚集体破碎的孔径的筛网。通常，用解离试剂预处理聚集体。同样，该方法对PSC造成环境威胁(stress)，然后使PSC变得凋亡或开始分化。

酶解离以及机械解离通常手动进行，以允许控制和监察整个过程。另外，聚集体或细胞通常通过离心从细胞培养基或解离试剂中分离，这可能导致细胞“结块(clumping)”。在生产治疗性产品的GMP生产过程中，这两者都应特别避免，这不仅是因为其是劳动密集型的并因此是昂贵的，而且因为每个手动单元操作都将增加微生物污染和批次间差异的风险。

因此，仍然需要允许在封闭系统中扩增PSC的细胞解离或传代方法，在该方法中，PSC聚集体的解离和重新形成的整个过程可以重复进行，无需从系统中移出细胞或聚集体，并且无需将细胞暴露于与酶/机械消化和/或离心相关的威胁。因此，技术问题是要满足这种需求。

发明内容

该技术问题通过权利要求中限定的主题来解决。本文提供了一种在生物反应器中以悬浮培养扩增多能干细胞(PSC)的方法。