[发明专利]修饰的核酸内切酶和相关方法

权利要求书

1.一种修饰的核酸内切酶，其包括核酸内切酶和与所述核酸内切酶共价连接的一个或多个混合电荷部分，其中每个混合电荷部分包括约10至约400个带正电荷的部分和约10至约400个带负电荷的部分，并且其中带正电荷的部分的数目与带负电荷的部分的数目的比率为约1：0.5至约1：2。

2.权利要求1所述的修饰的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶是核酸引导的核酸酶系统蛋白。

3.权利要求1或2中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶是CRISPR相关(Cas)蛋白。

4.权利要求1-3中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶是Cas9、Cas12、Cas13、Cas14，或其突变体或变体。

5.权利要求1-4中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶是Cas9或其突变体或变体。

6.权利要求1-5中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述混合电荷部分在约7.4的pH下基本上是电中性的。

7.权利要求1-6中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶在CRISPR/Cas系统中具有活性，其中所述CRISPR/Cas系统相对于野生型CRISPR/Cas系统表现出降低的脱靶编辑活性和维持的在靶编辑活性。

8.权利要求7所述的修饰的核酸内切酶，其中与未修饰的核酸内切酶相比，所述脱靶编辑活性降低至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％。

9.权利要求1-8中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述混合电荷部分与所述核酸内切酶的氨基酸的侧链、所述核酸内切酶的N端氨基和/或所述核酸内切酶的C端羧基共价连接。

10.权利要求1-9中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述混合电荷部分是分子量为约2kDa至约130kDa的肽。

11.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述的修饰的核酸内切酶是融合蛋白，其中所述混合电荷部分是由以下组成的混合电荷结构域：

a)多个带负电荷的氨基酸；

b)多个带正电荷的氨基酸；以及

c)任选的多个独立地选自脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸及其衍生物的另外的氨基酸；以及

其中带正电荷的氨基酸的数目与带负电荷的氨基酸的数目的比率为约1：0.5至约1：2。

12.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述多个带负电荷的氨基酸独立地选自天冬氨酸、谷氨酸及其衍生物。

13.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述多个带正电荷的氨基酸独立地选自赖氨酸、组氨酸、精氨酸及其衍生物。

14.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述混合电荷结构域不包括多个另外的氨基酸。

15.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述多个带正电荷的氨基酸是赖氨酸，并且多个带负电荷的氨基酸是谷氨酸。

16.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述混合电荷结构域包括随机序列。