[发明专利]修饰的核酸内切酶和相关方法

说明书

提供了用于产生具有降低的脱靶活性的修饰的核酸内切酶，如CRISPR/Cas9系统的组合物和方法。还公开了体外和体内使用所述修饰的核酸内切酶编辑多核苷酸的方法。一方面，公开内容提供了修饰的核酸内切酶，包括核酸内切酶和与所述核酸内切酶共价连接的一个或多个混合电荷部分，其中每个混合电荷部分包括约10至约400个带正电荷的部分和约10至约400个带负电荷的部分，并且其中带正电荷的部分的数目与带负电荷的部分的数目的比率为约1：0.5至约1：2。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年10月11日提交的美国临时申请第62/913,916号的权益，其公开内容通过引用以其整体并入本文。

关于序列表的声明

与该申请相关的序列表以文本格式提供，替代纸印本，并且特此通过引用并入说明书中。包括序列表的文本文件的名称为72968_SEQ_final-2020-10-7.txt。文本文件大小为27.2KB，于2020年10月7日创建，并随同说明书的提交通过EFS-web提交。

政府许可权利的声明

该发明是在美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的批准号为R21 GM128004号的政府支持下完成的。政府对发明拥有某些权利。

背景

CRISPR/Cas系统是在各种生物体和细胞类型中广泛使用的用于基因组编辑的工具。不幸的是，它也可能在类似于在靶序列的脱靶位点引起不需要的突变。脱靶突变是由CRISPR/Cas9 RNP对DNA序列的非特异性识别引起的。已经证明，除了最佳PAM序列5’-NGG-3’之外，Cas9还可以采用5’-NAG-3’或5’-NGA-3’PAM切割位点，尽管效率较低。此外，20nt单向导RNA(sgRNA)可识别具有多至3-5个与sgRNA的碱基对错配的DNA序列，表明在人类基因组中给定核酸酶存在多达数千个可能的结合位点。此外，与RNA引导链相比，CRISPR/Cas9可以诱导对包含几个额外碱基(‘DNA凸起’)或几个缺失碱基(‘RNA凸起’)的DNA序列的脱靶切割。脱靶DNA切割可在非预期的基因组基因座产生突变和产生总染色体重排，如缺失、倒位和易位。这些在不需要的位点的突变可能使抑癌基因失效或激活致癌基因。已知易位是慢性髓性白血病的可能原因。

防止、避免或至少减少这些脱靶效应对于任何下游基因组编辑应用的成功都是至关重要的。已经开发了各种策略来减少通常使用的Cas9核酸酶的基因组范围的脱靶突变，包括带有缩短的靶互补区的截短的sgRNA、Cas9突变体、配对的Cas9切口酶，以及无催化活性的Cas9与非特异性FokI核酸酶的二聚融合体。然而，这些方法仅部分有效和/或有产生更多脱靶位点的可能性。此外，它们还可能需要表达多个sgRNA和/或将额外的功能结构域融合到Cas9，这会缩小靶向范围，并对使用具有有限的核酸有效载荷大小的病毒载体进行递送造成挑战。

因此，仍然需要可以减少CRISPR/Cas9系统的脱靶效应的简单稳健的策略和具有减少的脱靶效应的CRISPR/Cas9系统。

概述

提供该概述从而以简化形式介绍将在以下详细描述中进一步描述的一些概念。该概述不旨在确认所要求保护的主题的关键特征，也不旨在被用于帮助确定所要求保护的主题的范围。

一方面，公开内容提供了一种修饰的核酸内切酶，其包括核酸内切酶和与核酸内切酶共价连接的一个或多个混合电荷部分，其中每个混合电荷部分包括约10至约400个带正电荷的部分和约10至约400个带负电荷的部分，并且其中带正电荷的部分的数目与带负电荷的部分的数目的比率为约1：0.5至约1：2。在一些实施方案中，混合电荷部分在约7.4的pH下基本上是电中性的。