[发明专利]一种用于鲑鳟鱼养殖的寄生虫快速酶免疫检测方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种用于鲑鳟鱼养殖的寄生虫快速酶免疫检测方法及试剂盒，属于养殖鱼类寄生虫检测技术领域。为解决现有鲑鳟鱼领域寄生虫检测方法特异性差、效率低、成本高的问题，本发明提供了一种用于鲑鳟鱼养殖的寄生虫快速酶免疫检测试剂盒，包括寄生虫特异性抗原包被板、含有0.5％吐温的0.1M磷酸盐缓冲液、酶标抗原溶液、30％过氧化氢溶液、四甲基联苯胺显色剂、2N硫酸溶液、阳性对照血清和阴性对照血清。本发明检测方法及试剂盒针对多种鲑鳟鱼养殖中常见的寄生虫具有良好的特异性和灵敏度，能够快速、高效、准确鉴定出鱼体感染的寄生虫种类，准确指导用药。本发明检测试剂盒成本低廉，操作简单，适合规模化鲑鳟鱼养殖场现场使用。

技术领域

本发明属于养殖鱼类寄生虫检测技术领域，尤其涉及一种用于鲑鳟鱼养殖的寄生虫快速酶免疫检测方法及试剂盒。

背景技术

鲑鳟鱼类是典型的冷水性鱼类，经济价值高，是世界重要经济养殖鱼类之一。然而，随着鲑鳟鱼养殖产量的攀升，养殖密度增大、养殖环境恶化造成的鲑鳟鱼类寄生虫病的发生和危害也日趋频繁和严重，制约了鲑鳟鱼养殖产业的健康发展。鲑鳟鱼常见的危害较为严重的寄生虫主要包括三代虫、小瓜虫、车轮虫。这些寄生虫生活史简单、繁殖速度快，大多寄生在鱼体表面及体内的各种组织器官上，导致鱼体生长缓慢、抵抗力下降，引起鱼体损伤并造成死亡。

传统的水产养殖寄生虫病的寄生虫学诊断需要对患病鱼体的皮肤、粘膜组织或病变组织活检打孔刮出，涂片培养后在显微镜下观察虫体图像进行鉴别。由于寄生虫虫体较小，容易漏检，对检测熟练程度要求较高，普通养殖人员不易操作，极易误诊。基于PCR技术建立的分子检测方法只能在实验室中进行，所需仪器昂贵，对检测人员要求较高，且检测效率低，不能及时有效的指导鲑鳟鱼养殖场寄生虫病的防治。

鲑鳟鱼养殖领域目前亟需一种能够在养殖现场进行检测并快速提供检测结果的、廉价高效的寄生虫检测方法。

发明内容

为解决现有鲑鳟鱼领域寄生虫检测方法特异性差、效率低、成本高的问题，本发明提供了一种用于鲑鳟鱼养殖的寄生虫快速酶免疫检测方法及试剂盒。

本发明的技术方案：

一种用于鲑鳟鱼养殖的寄生虫快速酶免疫检测试剂盒，包括寄生虫特异性抗原包被板、含有0.5％吐温的0.1M磷酸盐缓冲液、酶标抗原溶液、30％过氧化氢溶液、四甲基联苯胺显色剂、2N硫酸溶液、阳性对照血清和阴性对照血清。

进一步的，所述寄生虫特异性抗原包被板是将寄生虫虫体可溶性抗原包被于96孔板。

进一步的，所述寄生虫特异性抗原包被板的具体制备方法为：用pH为9.5的0.05M碳酸盐缓冲液将寄生虫虫体可溶性抗原溶液稀释至蛋白浓度为0.5mg/mL，向96孔板每个孔中加入100μL稀释后的寄生虫虫体可溶性抗原溶液，密封孔板并置于4℃下保存18h；在每个孔中加入含有5wt％普通山羊血清的磷酸盐缓冲溶液300μL，4℃放置8h去除未吸附的抗原；去除孔中剩余液体，真空冻干、真空封装后置于4℃保存备用。

进一步的，所述寄生虫虫体可溶性抗原的制备方法为显微镜下将寄生于鱼体的寄生虫取下，放入生理盐水中，虫体密度达到10⁶～10⁷/mL时，4℃下离心收集虫体，用pH7.0的PBS缓冲液清洗虫体3次，清洗后的虫体按虫体压积量加5倍体积的pH7.0的PBS缓冲液，在液氮和45℃水浴中反复冻融10次后在冰浴中超声粉碎，4℃离心，上清即为寄生虫虫体可溶性抗原。

进一步的，所述寄生虫为三代虫、小瓜虫、指环虫、复口吸虫和/或车轮虫。

进一步的，所述酶标抗原溶液的制备方法为取寄生虫虫体可溶性抗原10mg，加N,N-二甲基甲酰胺200μL溶解抗原得到Ⅰ液；取辣根过氧化物酶100mg，加蒸馏水溶解，加入EDC10mg并搅拌30min，得到Ⅱ液；将Ⅰ液滴加到Ⅱ液中，4℃避光反应18h，将反应液在4℃、pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，得到酶标抗原溶液。