[发明专利]一种含有非变性II型胶原和壳寡糖的复合物及其制备方法

说明书

本发明公开了一种含有非变性II型胶原和壳寡糖的复合物及其制备方法，该方法包括非变性II型胶原活化，活化剂去除和壳寡糖偶联等步骤，通过控制非变性II型胶原与活化剂的比例以及壳寡糖的加入量，可调控复合物中非变性II型胶原和壳寡糖的比例，以及复合物表面电荷种类以及电荷数量，以降低复合物在体内的降解率和肠道内的吞噬率。该方法具有实施过程简单、操作步骤少和效率高等优点。

技术领域

本发明属于生物技术中的蛋白质复合物制备技术，具体地，本发明涉及一种含有非变性II型胶原与壳寡糖通过适当方式形成的复合物的制备方法。

技术背景

胶原是一种由动物细胞表达的具有三螺旋结构的天然生物高分子，作为细胞外基质的主要成分几乎存在于所有组织，约占哺乳动物体内总蛋白的1/3，广泛存在于动物的皮肤、跟腱、软骨和其它结缔组织。胶原在组织内起着支撑和连接的作用，并影响细胞的分化、增殖、迁移和黏附等，对组织的形态、机械强度以及组织内的新陈代谢等也具有重要影响。目前在哺乳动物体内已发现28不同类型的胶原。不同类型胶原在动物体内的分布状态、存在型式、合成与代谢途径等各不相同。

II型胶原多存在于关节软骨和骨骼等组织，主要由动物体内的软骨细胞分泌。II型胶原属成纤维胶原，在体内交织成坚固的网架机构以保持软骨结构的完整性，并为软骨组织提供张力和承载力。II型胶原具有特异性分子识别信号，能促进软骨细胞粘附、增殖和分化，比I型胶原更有利于软骨细胞表型形成及结构维持。II型胶原的表达和代谢异常以及分子结构的变性会引起多种疾病。

类风湿性关节炎是与II型胶原的自身免疫反应有关的一种疾病，是以关节滑膜炎为主要特征的慢性自身性疾病，其病理机制的关键在于关节反复出现炎症，其形成主要由有滑膜衬里细胞增生、间质大量炎性细胞浸润以及血管新生和形成及软骨和骨组织的破坏等；类风湿性关节炎会引起人体内富含II型胶原部位的多种疾病，属于免疫性疾病。

通过口服II型胶原来诱导免疫耐受对类风湿性关节炎具有显著防治作用，II型胶免疫决定簇能与人体内的抗原相结合，形成的复合物再经分泌途径呈现于抗原递呈细胞表面，供受体特异性免疫相关细胞的表面受体所识别并形成复合体，特异性免疫相关细胞被活化、增殖并分泌各种免疫因子而启动免疫应答，从而使局部肠相关淋巴组织特异免疫从而抑制全身免疫应答，是一种外周免疫耐受形式。

传统的II型胶原在口服后会在人体胃部降解，降低了在肠道内的定向释放率；同时天然状态表面II型胶原表面的氨基酸分布多为负电荷，不利于胶原被肠道表面的细胞吞服，因此往往效果不佳。通过适当途径提升非变性II型胶原在肠道内的定向释放比例并提高其被肠道细胞的吞噬率有助有提高治疗效果。

发明内容

针对传统的非变性II型胶原在使用过程存在的低释放比例以及低吞噬率导致的对关节炎治疗效果的局限性，本发明旨在提供一种含有非变性II型胶原和壳寡糖的复合物及其制备方法，本发明是通过以下具体方式实现的。一种含有非变性II型胶原和壳寡糖的复合物及其制备方法，其特征在于复合物中非变性II型胶原与壳寡糖以化学键结合的形式存在，非变性II型胶原与壳寡糖的比例范围在1:200～100:1，其制备方法包括以下步骤：

(1)活化：取一定量的含有非变性II型胶原的粉或颗粒物，加入活化剂后进行均匀混合，在0-80℃范围内保存1min-300min。

(2)筛分：使用筛网将步骤(1)得到的混合物进行筛分，去除未参与反应的活化剂。

(3)偶联：向步骤(2)获得的去除了未参与反应活化剂的混合物中加入壳寡糖，在0-80℃范围内进行动态混合1min-300min。

(4)干燥：将步骤(3)获得的混合物进行干燥，将含水量控制在8％以下，所得产物即为含有非变性II型胶原和壳寡糖的复合物

优选的，所述步骤(1)加入的活化剂可以是大豆黄酮、大豆异黄酮、花青素、花色苷、茶多酚、二氢杨霉素或含有以上物质的植物提取。