[发明专利]一种用于外泌体提取的双重切向流过滤体系及外泌体的制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种用于外泌体提取的双重切向流过滤体系及外泌体的制备方法与应用。所述方法包括：含外泌体的样本溶液于第一储存罐中，泵入第一过滤装置，循环浓缩过滤，收集滤过液至第二储存罐中；待第一储存罐中的液体体积浓缩至最小运行体积时，将第二储存罐中的液体泵入第二过滤装置中，进行循环浓缩过滤；收集第二储存罐中液体，即得到提取纯化的外泌体溶液。外泌体可用于外泌体医美类产品，促进伤口愈合的外泌体液体敷料，缓解哮喘及急性呼吸窘迫症的外泌体喷雾，以及外泌体相关生物制品的制备。本发明是通过两种不同孔径的切向流过滤膜提取纯化外泌体，既可以去除样本中颗粒较大的细胞微囊泡及细胞碎片，又可以最大程度的提取浓缩外泌体。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种用于外泌体提取的双重切向流过滤体系及外泌体的制备方法与应用。

背景技术

外泌体是有活细胞分泌的磷脂双分子层结构的小囊泡，直径在30-150nm，密度在1.13-1.19g/ml，可存在于各种体液中，如血清、血浆、唾液、尿液、腹水、脊髓液、乳汁等。外泌体中含有多种生物分子，如mRNA、miRNA、蛋白质、脂质等，可以传递给受体细胞，从而改变受体细胞的生理功能或病理功能。近几年，外泌体作为细胞间的信息传递工具及各种疾病的生物标志物而引起广泛的关注，外泌体具有在生物医药及疾病诊断领域的应用具有很大的潜力。

获得高纯度、高产量、标准化的外泌体，是外泌体用于临床应用的前提条件。然而，目前针对外泌体的提取纯化方法还没有统一的标准，常用的方法有很多种，超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、聚合物沉淀法、免疫捕获法等。超速离心法虽然是公认的外泌体提取的“金标准”方法，但是操作费时费力、高度依赖人工，回收率低，外泌体形态大小不一，高速离心会损害外泌体而影响下游实验。密度梯度离心法虽然可以获得很纯的外泌体，但该方法操作繁琐，重复性差，耗时很长，回收率低，不适合大批量提取外泌体。超滤法可以方便快速的提取外泌体，但该方法提取的外泌体中含有大颗粒杂质污染，严重影响下游应用。聚合物沉淀法操作简单方便，可以用于大体积样本的外泌体提取，但该方法提取的外泌体中杂蛋白污染较多，颗粒形态不均一，影响下游分析。免疫捕获法虽然可以特异性地捕获外泌体，获得的外泌体纯度高，但该方法成本高且产量低，不能提取样本中所有的外泌体，只能提取某种表面抗原阳性的外泌体。所以，目前常用的外泌体提取方法只限于实验室操作，没有一种适合大规模的外泌体工业化的提取方法。因此，为了加速外泌体的临床转化，急须一种操作简单，样本处理量大、可重复好且适合大规模GMP级制备外泌体的方法。

发明内容

为此，本发明提供一种用于外泌体提取的双重切向流过滤体系及外泌体的制备方法与应用，以解决现有技术中操作复杂、样本量小、重复性差，不能用于大规模GMP级制备外泌体的问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

根据本发明一方面提供的一种用于外泌体提取的双重切向流过滤体系制备外泌体的方法，所述方法包括：

步骤一，将样本溶液进行预处理，得含外泌体的样本溶液；

步骤二，将所述含外泌体的样本溶液置于第一储存罐中，打开第一蠕动泵，将含外泌体样本溶液泵入第一过滤装置中，循环浓缩过滤，收集滤过液至第二储存罐中；

步骤三，待第一储存罐中的液体体积浓缩至最小运行体积时，向第一储存罐中加入无菌PBS缓冲液，继续将第一储存罐中液体泵入第一过滤装置中，继续循环浓缩过滤，收集过滤液至第二储存罐中；

步骤四，待第一储存罐中的液体体积浓缩至最小运行体积时，打开第二蠕动泵，将第二储存罐中的液体泵入第二过滤装置中，进行循环浓缩过滤；

步骤五，待第二储存罐中的液体体积浓缩至最小运行体积时，向第二储存罐中加入无菌PBS缓冲液，继续将第二储存罐中的液体泵入第二过滤装置中，循环浓缩过滤，待第二储存罐中液体体积浓缩至一定体积，收集第二储存罐中液体，即得到提取纯化的外泌体溶液；