[发明专利]一种基于L-苏氨酸醛缩酶生物合成屈昔多巴的方法

权利要求书

1.一种基于L-苏氨酸醛缩酶生物合成屈昔多巴的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，构建表达外源基因的基因工程菌

当外源基因为ItaE时，所得基因工程菌为BL21（DE3）/ pET28a-ItaE，

当外源基因为STA时，所得基因工程菌为BL21（DE3）/ pET28a-STA，

当外源基因为LTA时，所得基因工程菌为BL21（DE3）/ pET28a-LTA，或

当外源基因为P-TA时，所得基因工程菌为BL21（DE3）/ pET28a-P-TA；

步骤2，提取大肠杆菌MG1655的基因组

挑取大肠杆菌MG1655单菌落，接种于LB培养基，37℃培养12h，收集大肠杆菌细胞，提取其基因组；

步骤3，挑取基因工程菌的单菌落，接种于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6以上，再加入0.25mM-1mM的IPTG，15-30℃培养12-18小时，离心收集基因工程菌；

步骤4，用pH 6-11的PBS缓冲液重悬步骤3收集的基因工程菌；

步骤5，选取3,4-二羟基苯甲醛作为底物，甘氨酸为辅底物，5-磷酸吡哆醛为辅因子，再添加缓冲溶液调节反应体系的pH至6-11，再加入步骤4中用PBS缓冲液重悬的基因工程菌湿细胞液OD₆₀₀10-200，20-60℃反应0.5h-24h；其中3,4-二羟基苯甲醛的终浓度为20-200mM/L，甘氨酸的终浓度为0.1-2M/L，5-磷酸吡哆醛的终浓度为1-20μM/L；

步骤6，待催化反应结束后，加入等体积的1N稀盐酸，12000rpm离心2min，取上清液检测产物生成情况。

2.根据权利要求1所述的一种基于L-苏氨酸醛缩酶生物合成屈昔多巴的方法，其特征在于，步骤1中所述的外源基因ItaE根据已报道的铜绿假单胞杆菌来源L-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行密码子优化后，全基因合成优化后的序列；外源基因STA根据已报导的链霉菌来源L-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行密码子优化后，全基因合成优化后的序列；外源基因P-TA根据已报导的恶臭假单胞杆菌来源L-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行密码子优化后，全基因合成优化后的序列；外源基因LTA根据已报导的大肠杆菌来源L-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行克隆，异源表达后的序列。

3.根据权利要求2所述的一种基于L-苏氨酸醛缩酶生物合成屈昔多巴的方法，其特征在于，构建基因工程菌BL21（DE3）/ pET28a-LTA的具体步骤如下：

设计上游引物带有BamHⅠ酶切位点：cgcggatccATGATTGATTTACGCAGTG；

设计下游引物带有HindⅢ酶切位点：cccaagcttACGCGCCAGGAATGCACGCC；

以大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板扩增得到片段LTA，将保在大肠杆菌T1中的pET28a质粒进行提取，选取酶切位点BamH I和HindⅢ，将片段和质粒都进行双酶切操作，酶切完成后分别进行胶回收，完成后检测下质粒浓度，使用T4 DNA Ligase将胶回收之后的质粒和片段进行连接后，转化感受态,涂板于带有卡那霉素抗性的平板上隔夜培养，待平板上长出单菌落后使用质粒通用引物进行菌落PCR验证，同时划线于相同抗性的平板上培养12-16h，经核酸凝胶电泳验证后挑选正确的阳性结果进行提质粒并经公司测序，确认插入序列无误即为成功构建质粒Pet28a-LTA，获得重组质粒pET28a-LTA，将构建好的重组质粒pET28a- LTA用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到表达L-苏氨酸醛缩酶菌种BL21（DE3）/pET28a-LTA。