[发明专利]一种基于L-苏氨酸醛缩酶生物合成屈昔多巴的方法

说明书

本发明公开了一种基于L‑苏氨酸醛缩酶生物合成屈昔多巴的方法，该发明以BL21DE3为出发菌株，在出发菌株基础上过表达了来源于铜绿假单胞杆菌中编码L‑苏氨酸醛缩酶的ItaE基因、恶臭假单胞杆菌中编码L‑苏氨酸醛缩酶的P‑TA基因、大肠杆菌中编码L‑苏氨酸醛缩酶的LTA基因，或链霉菌中编码L‑苏氨酸醛缩酶的STA基因，通过上述操作得到工程菌，通过离心收集得到的湿细胞进行反应后得到屈昔多巴的产量为3.3‑4.15g/L。与现有技术相比，本发明方法生物合成法有着绿色，高产，条件温和等优点，尤其是副产物少，对环境友好度高。

技术领域

本发明属于屈昔多巴的制备技术领域，具体涉及一种基于L-苏氨酸醛缩酶生物合成屈昔多巴的方法。

背景技术

屈昔多巴(L-threo-DOPS)是一种新的抗帕金森氏病药物，用于改善由帕金森病引起的步态僵直和直立性头晕；改善由Shy-Drager综合征或家族性淀粉样神经病所致的直立性低血压、直立性头晕和昏厥；改善血液透析患者由于直立性低血压引发的头晕和乏力。目前制备屈昔多巴的方法主要为化学法，面临着副产物多，拆分分离困难等问题，因此制备成本较高。

L-苏氨酸醛缩酶(threonine aldolases，TAs)可以催化不同类型的醛与α-氨基酸发生醇醛缩合反应，生成氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、肾上腺素、屈昔多巴、万古霉素、鞘脂菌素等许多活性医药物成分中的核心片段。因此，TAs在生物合成屈昔多巴中具有重要的应用价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于L-苏氨酸醛缩酶生物合成屈昔多巴的方法，该方法反应条件温和，易控制，成本低廉，避免了化学合成过程中副产物多、拆分成本高的问题，降低其制备成本。

一种基于L-苏氨酸醛缩酶生物合成屈昔多巴的方法，包括以下步骤：

步骤1，构建表达外源基因的基因工程菌

当外源基因为ItaE时，所得基因工程菌为BL21(DE3)/pET28a-ItaE；

当外源基因为STA时，所得基因工程菌为BL21(DE3)/pET28a-STA；

当外源基因为LTA时，所得基因工程菌为BL21(DE3)/pET28a-LTA；

当外源基因为P-TA时，所得基因工程菌为BL21(DE3)/pET28a-P-TA；

步骤2，提取大肠杆菌MG1655的基因组

挑取大肠杆菌MG1655单菌落，接种于LB培养基，37℃培养12h，收集大肠杆菌细胞，提取其基因组；

步骤3，挑取基因工程菌的单菌落，接种于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6以上，再加入0.25mM-1mM的I PTG，15-30℃培养12-18小时，离心收集基因工程菌；

步骤4，用pH 6-11的PBS缓冲液重悬步骤3收集的基因工程菌；

步骤5，选取3,4-二羟基苯甲醛作为底物，甘氨酸为辅底物，5-磷酸吡哆醛为辅因子，再添加缓冲溶液调节反应体系的pH至6-11，再加入步骤4中用PBS缓冲液重悬的基因工程菌湿细胞液OD₆₀₀10-200，20-60℃反应0.5h-24h；其中3,4-二羟基苯甲醛的终浓度为20-200mM/L，甘氨酸的终浓度为0.1-2M/L，5-磷酸吡哆醛的终浓度为1-20μM/L；

步骤6，待催化反应结束后，加入等体积的1N稀盐酸，12000rpm离心2min，取上清液检测产物生成情况。