[发明专利]游离锌离子浓度的荧光检测方法、曲线建立方法及试剂盒

权利要求书

1.一种游离锌离子浓度的荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)分离待测胰岛β细胞；

(2)使用携带目标基因的腺病毒感染所述待测胰岛β细胞；

所述目标基因是连接了NPY基因的编码金属锌传感器的核苷酸序列，所述金属锌传感器基于人源TRIM72蛋白的环状基序，所述环状基序的N端连接mNeonGreen荧光蛋白分子，所述环状基序的C端连接mRuby2荧光蛋白分子；

(3)所述腺病毒感染待测胰岛β细胞后，清洗细胞，于细胞培养箱中培养后进行胰岛β细胞的活体荧光显微镜成像；荧光显微镜成像采用单通道：用521～601nm激光激发mRuby2，收集mRuby2发射的红色荧光；

(4)利用检测步骤(3)中收集的mRuby2荧光强度，根据游离锌离子浓度-mRuby2荧光强度工作曲线计算出待测胰岛β细胞囊泡中的平均游离锌离子浓度。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述感染时间为7～9小时。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述感染时间为8小时。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述激光波长为561nm。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中的所述游离锌离子浓度-mRuby2荧光强度工作曲线的建立需要三通道成像，通过第一通道和第二通道采集到的荧光强度，由公式计算出游离锌离子浓度，作为横坐标；第三通道中的mRuby2荧光强度作为纵坐标；使用一元一次方程进行线性拟合，得到游离锌离子浓度-mRuby2荧光强度工作曲线。

6.一种游离锌离子浓度-mRuby2荧光强度工作曲线的建立方法，包括如下步骤：

(S1)分离胰岛β细胞；

(S2)使用携带目标基因的腺病毒感染胰岛β细胞；

所述目标基因是连接了NPY基因的编码金属锌传感器的核苷酸序列，所述金属锌传感器基于人源TRIM72蛋白的环状基序，所述环状基序的N端连接mNeonGreen荧光蛋白分子，所述环状基序的C端连接mRuby2荧光蛋白分子；

(S3)所述腺病毒感染胰岛β细胞后，清洗细胞，于细胞培养箱中培养后进行胰岛β细胞的活体荧光显微镜成像；荧光显微镜成像分为三个独立的通道：第一通道采用448～528nm激光激发mNeonGreen，收集mNeonGreen发射的绿色荧光；第二通道采用448～528nm激光激发mNeonGreen，收集mRuby2发射的红色荧光；第三通道采用521～601nm激光激发mRuby2，收集mRuby2发射的红色荧光；

(S4)根据所述第一通道和所述第三通道的荧光信号选择出第一通道和第三通道中共定位的囊泡，测量得到每个所述共定位的囊泡在第三通道中的mRuby2荧光强度；根据第一通道和第二通道采集到的荧光强度，由如下公式(1)和公式(2)计算出每个囊泡中的游离锌离子浓度，

其中，I(mRuby2)为第二通道中收集到的mRuby2发射的红色荧光强度，I(mNeon)为第一通道中收集到的mNeonGreen发射的红色荧光强度，R为荧光共振能量转移的比率，Zn²⁺为锌离子浓度，K_d为基于人源TRIM72蛋白的环状基序的金属锌传感器的解离常数；I(mRuby2)_b为结合锌离子的所述金属锌传感器在595nm处的荧光强度，I(mRuby2)_u为非结合锌离子的所述金属锌传感器在595nm处的荧光强度，I(mNeon)_b为结合锌离子的所述金属锌传感器在535nm处的荧光强度，I(mNeon)_u为非结合锌离子的所述金属锌传感器在535nm处的荧光强度；

(S5)对步骤(S4)中获得的每个囊泡中的游离状态锌离子浓度和在第三通道中的mRuby2荧光强度进行相关性分析，使用一元一次方程进行线性拟合，得到游离锌离子浓度-mRuby2荧光强度工作曲线。