[发明专利]游离锌离子浓度的荧光检测方法、曲线建立方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种游离锌离子浓度的荧光检测方法、曲线建立方法及试剂盒，本发明的检测方法使用携带目标基因的腺病毒感染待测胰岛β细胞，所述目标基因是连接了NPY基因的编码金属锌传感器的核苷酸序列；然后用单通道荧光显微镜进行胰岛β细胞的活体成像，获得发射的红色mRuby2荧光强度；再根据游离锌离子浓度‑mRuby2荧光强度工作曲线计算得出待测胰岛β细胞囊泡中的游离锌离子浓度。所述检测方法对成像设备的要求低，工作曲线建立后，只需要使用单通道的荧光成像设备，操作起来更加简便，不需要再经过复杂的运算，能够直接通过测量单通道的mRuby2荧光强度一步获得囊泡中的平均游离锌离子浓度，显著提高测量的效率。

技术领域

本发明涉及细胞生物学和医学领域，特别涉及一种胰岛β细胞囊泡中游离锌离子浓度的荧光检测方法、曲线建立方法及试剂盒。

背景技术

荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)是指距离很近(一般在10nm范围以内)的两个荧光分子之间产生的能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，且两个分子距离足够近时，就会发生一种非放射性能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光猝灭(强度比它单独存在时低)，而受体发射的荧光大大增强。

2型糖尿病或者其他β细胞缺锌造成的疾病，其患者β细胞囊泡中的游离锌离子浓度显著低于正常的β细胞。现有技术只能通过荧光共振能量转移技术(FRET)对β细胞囊泡中游离的锌离子进行测量，对成像设备要求高，需要双通道的激光和复杂的计算过程。

在此前的研究中，报道了使用人源TRIM72(MG53)蛋白的环状基序(ring motif)得到的金属锌传感器，并在其N端和C端分别连接了mNeonGreen和mRuby2的荧光蛋白分子作为FRET对。由于金属锌传感器与锌离子结合后构象发生变化，FRET对mNeonGreen和mRuby2距离被拉近，发生FRET现象，这种方法可以测量β细胞囊泡中的游离锌离子的浓度。但是这种方法要先通过双通道的成像设备分别得到不同通道下mNeonGreen和mRuby2的荧光强度，计算得到FRET的比率，之后再经过非常复杂的推导和计算公式得到游离锌离子的浓度，上述方法具有两个明显的缺陷：(1)需要使用双通道的荧光成像设备，此类设备购买费用高昂，一般的实验单位不易配备，操作步骤也很复杂；(2)计算过程复杂，计算过程不止一步，且公式中的参数众多，不能够一步得到囊泡中的游离锌离子浓度，导致测量效率低下。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种游离锌离子浓度的荧光检测方法、曲线建立方法及试剂盒，本发明的检测方法使用携带目标基因的腺病毒感染待测胰岛β细胞，所述目标基因是连接了NPY基因的编码金属锌传感器的核苷酸序列；然后用单通道荧光显微镜进行胰岛β细胞的活体成像，获得发射的红色mRuby2荧光强度；再根据游离锌离子浓度-mRuby2荧光强度工作曲线计算得出待测胰岛β细胞囊泡中的平均游离锌离子浓度。

本发明提供一种游离锌离子浓度的荧光检测方法，包括如下步骤：

(1)分离待测胰岛β细胞；

(2)使用携带目标基因的腺病毒感染所述待测胰岛β细胞；

所述目标基因是连接了NPY基因的编码金属锌传感器的核苷酸序列，所述金属锌传感器基于人源TRIM72蛋白的环状基序，所述环状基序的N端连接mNeonGreen荧光蛋白分子，所述环状基序的C端连接mRuby2荧光蛋白分子；CPLC-CGHSFCRAC-CPCC，是两个锌指的结合域，能够结合锌离子的关键区域蛋白序列，一分子蛋白其中的7个C残基(除去倒数第二个)及一个H残基一起结合2分子锌离子；mRuby2荧光蛋白荧光亮度更高，背景较少。

(3)所述腺病毒感染待测胰岛β细胞后，清洗细胞，于细胞培养箱中培养后进行胰岛β细胞的活体荧光显微镜成像；荧光显微镜成像只有一个通道：用521～601nm激光激发mRuby2，收集mRuby2发射的红色荧光；