[发明专利]文库制备方法、试剂盒及测序方法

权利要求书

1.一种制备文库的方法，其特征在于，包括：

获取目标核酸分子，包括：

对源自待测核酸样本的RNA进行逆转录，获得逆转录产物，所述逆转录产物包括RNA:DNA杂合双链，以及

富集所述逆转录产物中的RNA:DNA杂合双链，获得所述目标核酸分子；

提供转座复合体，所述转座复合体包含接头和转座酶，所述接头为序列已知的双链核酸分子；

使所述目标核酸分子和所述转座复合体置于适于转座反应的条件下接触，获得转座产物，所述转座产物包含末端带有接头且包含缺口的双链核酸分子；

提供第一引物，所述第一引物配置为能与所述接头的至少一部分杂交；以及

使所述转座产物与所述第一引物杂交并置于适于链置换反应的条件下，以获得所述文库。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA的起始量为5～50pg；

任选地，所述RNA的起始量为不小于10pg；

任选地，所述获取目标核酸分子还包括：在进行所述逆转录之前对所述RNA进行变性；

任选地，将所述RNA置于65℃中3～10min以进行所述变性。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，利用混合引物进行所述逆转录，所述混合引物包括Oligo dT和随机引物；

任选地，所述Oligo dT和所述随机引物在逆转录反应体系中的比例为1:2～1:6；

任选地，所述Oligo dT的长度为12～20nt，和/或所述随机引物的长度为4-8nt；

任选地，利用磁珠进行所述富集；

任选地，利用表面具有羧基修饰基团的磁珠进行所述富集；

任选地，所述转座酶为Tn5转座酶或其工程酶，和/或所述接头具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列；

任选地，还包括加入终止液以终止所述转座反应，所述终止液包含SDS；

任选地，所述第一引物具有如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列；

任选地，在进行所述链置换反应之后，对所述链置换反应产物进行PCR，进行所述PCR利用的反应体系与所述链置换的相同。

4.一种试剂盒，用于实施权利要求1-3任一所述的方法，以获得所述文库，该试剂盒包括：用于实现所述逆转录的第一试剂，用于实现所述富集的第二试剂、所述转座复合体和所述第一引物。

5.一种测序方法，其特征在于，包括：

利用权利要求1-3任一所述的方法制备文库；

对所述文库进行测序，获得测序结果。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在进行所述测序之前，所述方法包括：

使所述文库连接到固相基底表面，所述固相基底表面带有探针，所述探针配置为与所述接头的至少一部分杂交；

任选地，所述接头包括第一接头和第二接头，所述探针包括第一探针和第二探针，所述第一探针配置为与所述第一接头的至少一部分杂交，所述第二探针配置为与所述第二接头的至少一部分杂交，所述方法包括：

解链所述文库，获得单链文库；

使所述单链文库连接到所述固相基底表面；

在所述固相基底表面上对所述单链文库进行扩增，以获得测序模板；

任选地，所述扩增为桥式扩增或者模板步移扩增。