[发明专利]文库制备方法、试剂盒及测序方法

说明书

本发明提供文库制备方法、试剂盒及测序方法。所称的文库制备方法包括获取目标核酸分子，包括：对源自待测核酸样本的RNA进行逆转录，获得逆转录产物，逆转录产物包括RNA:DNA杂合双链，及富集逆转录产物中的RNA:DNA杂合双链；提供转座复合体，该转座复合体包含接头和转座酶，接头为序列已知的双链核酸分子；使目标核酸分子和转座复合体置于适于转座反应的条件下接触，获得转座产物，该转座产物包含末端带有接头且包含缺口的双链核酸分子；提供第一引物，第一引物配置为能与所述接头的至少一部分杂交；以及使转座产物与第一引物杂交并置于适于链置换反应的条件下，以获得文库。该方法特别适于低起始量的RNA文库的快速构建。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种文库制备方法、一种文库制备试剂盒以及一种测序方法。

背景技术

测序数据的质量与测序方法和测序文库有关。目前有很多研究致力于测序文库的构建优化及测序方法的优化。

对于微量核酸(如低于1ng)文库制备的过程中，核酸质量、制备方法、制备过程中所采用的反应条件包括溶液体系等的不当或异常，如核酸浓度过低、筛选的核酸片段大小不合适、反应体系中的多个组分在特定条件下可能互相作用、互相干扰等，都可能导致制备得质量较低或不合格的文库，以致不能用于测序。

而一般地，不同的测序平台都有相适配的文库和测序方法。

其中的单分子测序技术、单分子测序平台，一直代表着核酸检测技术的先进方向，早在上世纪八十年代就有人提出了单分子测序。2003年斯坦福大学生物工程系的教授Stephen Quake博士成功演示了第一个单分子DNA测序实验；2008年Helicos公司的第一台单分子测序仪(HeliScope)上市；2009年Korlach与Turner在《科学》杂志上发表文献介绍了PacBio单分子测序技术原理，随后，2010年PacBio公司推出了PacBio RS测序系统，并于2011年正式商用。2014年OxfordNanopore公司在AGBT(基因组生物学技术进展年会)上展示了其MinION测序系统。据报道，上述任一测序平台的single-pass(单程测序)的测序错误率均很高，最高可达30％，而且，错误类型主要是InDel(插入缺失)且是随机发生的。一般认为，通过多次读取可降低这种测序错误率。

因而，现有的是适配于边合成边测序的测序平台的文库构建方法和测序方法，均有待改进。

发明内容

至少为一定程度地解决上述现有技术问题至少之一，本发明提供了一种文库制备方法、一种文库制备试剂盒以及一种测序方法。

在本发明的实施方式中，提供一种制备文库的方法，包括：获取目标核酸分子，该目标核酸分子为双链核酸分子，包括：对源自待测核酸样本的RNA进行逆转录，获得逆转录产物，所述逆转录产物包括RNA:DNA杂合双链，和富集所述逆转录产物中的RNA:DNA杂合双链，以获得所述目标核酸分子；提供转座复合体，所述转座复合体包含接头和转座酶，所述接头为序列已知的双链核酸分子；使所述目标核酸分子和所述转座复合体置于适于转座反应的条件下接触，获得转座产物，所述转座产物包含末端带有接头且包含缺口的双链核酸分子；提供第一引物，所述第一引物配置为能与所述接头的至少一部分杂交；以及使所述转座产物与所述第一引物杂交并置于适于链置换反应的条件下，以获得所述文库。

上述文库制备方法属于RNA文库构建方法，相较于常规RNA文库制备，该方法操作简单、利于快速地制得文库，特别适用于低起始量的核酸样本的文库制备；具体地，利用转座复合物对高效富集后的RNA:DNA杂合双链进行转座处理，通过一个步骤在一个相同的溶液体系就实现了RNA:DNA杂合双链的片段化、片段化产物的修复以及片段化产物的接头连接，而且，不需纯化或分离地，在上一步反应的溶液体系中加入引物(第一引物)和聚合酶(非热启动DNA聚合酶)进行链置换反应以补平转座产物的核酸分子上的缺口，获得两端带有接头的目标核酸分子。利用该方法制备得的文库能够在各种测序平台上进行测序，且利于获得准确的测定结果。