[发明专利]一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种外源性GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，采用链霉亲和素包被的微孔酶标板，通过链霉亲和素和生物素结合拽取生物素偶联的GNP抗原，固相化生物素偶联的GNP抗原与游离的GNP竞争抗体，利于减小空间位阻以使得GNP不直接固定于微孔酶标板上，给予GNP抗原以柔性的反应空间并避免表位的遮盖；所述检测试剂盒包括：

组分A：预先包被链霉亲和素的微孔酶标板；

组分B：GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水或者纯化的GNP单克隆抗体；

组分C：生物素偶联的GNP多肽；

组分D：用于稀释纯化的GNP单克隆抗体或者GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水的样品稀释液；

组分E：用于稀释生物素偶联的GNP多肽的分析缓冲液；

组分F：GNP标准品；

组分G：辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG；

组分H：用于稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG的抗体稀释液；

组分G：TMB底物；

组分I：终止液；

使用所述检测试剂盒的GNP多肽的检测方法包括：将标准品、质控品、受试血清样本加入酶标板，随后同步加入GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水或者纯化GNP单克隆抗体进行孵育，受试血清样本中的游离态GNP与固相化生物素偶联的GNP竞争结合腹水或纯化GNP单克隆抗体上的位点，以在固相载体上形成抗原抗体复合物。

2.根据权利要求1所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液每升中包括：酪蛋白 4.5~5.5g，两性表面活性剂 2~3g，MgCl₂ 9~10g，γ-球蛋白 2~2.5g，NaCl₂ 0.5~29g，0.5M 的EDTA溶液8~15mL，动物血清 8~15mL，吐温-20 450~550μL。

3.根据权利要求1所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述分析缓冲液为牛血清蛋白-海藻糖-PBST溶液。

4.根据权利要求1所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述抗体稀释液为酪蛋白-PBS溶液。

5.根据权利要求1所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素偶联的GNP多肽为N端起10号位及30号位氨基酸。

6.根据权利要求1所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的检测方法包括以下步骤：

步骤（1）、在酶标板上预先包被链霉亲和素并封闭以制备固相载体；

步骤（2）、将生物素偶联的GNP多肽结合在固相载体上形成固相化抗原；

步骤（3）、将标准品、质控品、受试血清样本加入酶标板，随后同步加入GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水或者纯化GNP单克隆抗体进行孵育，受试血清样本中的游离态GNP与生物素偶联的GNP竞争结合腹水或纯化GNP单克隆抗体上的位点，以在固相载体上形成抗原抗体复合物；

步骤（4）、向步骤（3）的酶标板中加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，通过孵育使得羊抗小鼠IgG与固相载体上的抗原抗体复合物进一步结合，然后除去未结合的物质；

步骤（5）、向步骤（4）的酶标板中加入酶促反应TMB底物，底物被酶催化成为有色产物，随后加入终止液以终止颜色的发展；

步骤（6）、根据标准品回归拟合的标准曲线计算质控品及受试血清样本中的GNP浓度值。

7.根据权利要求6所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，步骤（1）中，用碳酸盐缓冲液将链霉亲和素稀释至0.5~2µg/mL，然后以50~150 µL/孔加入酶标板，于2-8℃孵育至少15 h；孵育结束后，以100~300µL/孔加入封闭液并在室温孵育2 h ± 15 min以获得固相载体。