[发明专利]一种交联琼脂糖亲和介质及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种交联琼脂糖亲和介质及其制备方法与应用，所述制备方法包括如下步骤：(1)将含琼脂糖的分散相与含乳化剂的连续相于微通道反应装置中反应，所得反应液于收集液中固化，得到琼脂糖微球；(2)将步骤(1)所得琼脂糖微球依次经如下步骤处理后得到交联琼脂糖亲和介质；(i)溶胀、活化、多羟基聚合物修饰；(ii)交联；(iii)活化、偶联亚氨基二乙酸配基；(iv)螯合镍离子。经修饰后的微球，用于酶的纯化和固定，解决了酶在复杂的分离纯化的过程中易失活和无法回收再利用等问题，同时合成的亲和介质用于酶的纯化，降低了酶液中杂酶对产物的影响，此方法制备胞苷酸，具有反应条件温和，绿色环保等优势。

技术领域

本发明属于酶的催化及应用技术领域，具体是一种交联琼脂糖亲和介质及其制备方法与在纯化酶和酶催化产胞苷酸中的应用。

背景技术

酶是一种由细胞产生的具有催化能力的生物催化剂，其本质上是一种蛋白质，它具有较高的催化效率，高度的专一特性，生物体内的各种化学反应都是在酶的催化作用下完成的。

酶的催化合成可以是一种或多种酶催化反应，反应既可以为平行进行的，也可以是并联合成更加复杂的化合物。在多酶体系中，酶进行有效催化需要辅酶因子的参与，如NADH、ATP等。ATP作为反应中的磷酸供体，价格昂贵。但用乙酸激酶催化乙酰磷酸和ADP生成ATP，可形成ATP的能量再生循环，促进反应的进行，乙酰磷酸价格便宜，利用乙酸激酶催化的ATP的再生，达到了节约成本的目的。

为了满足对一些大分子量的底物进行有效的催化，需要将酶工程重组的酶破碎获得粗提液，进行分离纯化得到的酶可用于底物的高效催化。目前蛋白质的分离纯化有沉淀法如盐析、生物碱或酸沉淀法；层析法如亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析；离心法等。对于不同的目标酶而言，不同的纯化方法有其特定的优点和缺点。固定化金属离子亲和层析(IMAC)是一种高效的亲和层析方法。因其螯合介质制备简单，吸附容量大，容易再生等优点得到越来越多的应用。用于IMAC的亲和配基有亚氨基二乙酸(IDA)、三羧甲基乙二胺(TED)和次氮基三乙酸(NTA)。基本原理就是蛋白表面的组氨酸残基的咪唑环或半胱氨酸残基与过渡金属离子(Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺)，螯合形成配体，达到分离纯化目标蛋白的目的。同时，IMAC柱可以再生重复使用。正因如此，固定化金属螯合层析法在蛋白质与核酸的分离纯化、蛋白质的定向固定中得到广泛应用。

然而，游离酶对外界环境非常敏感，易受热、强酸、强碱等极端条件的影响而失去活性，从而限制了其在工业应用的发展。

近年来，酶的固定化是酶的一项重要的应用技术，解决了上述酶存在的问题，酶的固定化是指以有机或无机固体材料作为载体，采用物理或化学方法将酶束缚、限制于其表面和微孔中。与游离酶相比，“定制”得到具有特殊用途的固定化酶的稳定性得到改进、能在苛刻的环境中表现优良的活性，增强了酶的使用寿命，节约了经济成本。酶的固定化方法有物理法和化学法两大类，物理法包括吸附和包埋法，化学法包括交联和共价结合法。酶的固定化方法各有其优缺点，因此设计和合成优异性能的酶固定化材料是解决酶的固定化问题的方法之一。

酶的固定化载体有无机载体(如石墨、羟基磷石灰等)，有机载体(如一些天然高分子材料等)，生物大分子载体(如海藻酸钠、壳聚糖等)。载体的物理化学性质极大的影响着蛋白质的吸附过程，选择适合的酶固定化载体要考虑到载体的机械强度、化学及热稳定性、生物相容性、比表面积和酶的类型等。近年来，琼脂糖因其良好的生物相容性与可降解性，在生物分离纯化领域中得到广泛应用。琼脂糖作为常用的载体材料，主要有以下优点：(1)具有多孔性：琼脂糖微球的大孔可容许大分子量物质的扩散；(2)具有亲水性：琼脂糖分子表面含有大量羟基，便于在亲水的环境中进行；(3)具有衍生性：琼脂糖表面由密度适宜的活性基团羟基容易与一些功能基团键合，衍生出阴、阳离子交换介质、亲和层析介质等，在整个生物产品的分离过程中起到了十分重要的作用。目前，琼脂糖微球的制备方法有传统的搅拌乳化法、喷雾干燥法、膜乳化法等。但通过上述方法容易导致合成的交联琼脂糖粒径不均一，设备要求高等问题。

发明内容