[发明专利]一种体外合成藏红花酸的方法

说明书

本发明涉及酶催化合成技术领域，公开了一种体外合成藏红花酸的方法。本发明所述方法构建CsCCD2基因和SynALD基因的表达质粒，转入宿主细胞进行蛋白表达，获得CsCCD2蛋白和SynALD蛋白；然后在含有FeSO₄、L‑抗坏血酸、TCEP、catalase和NAD⁺的缓冲液中加入底物玉米黄质和CsCCD2蛋白反应，至产物藏红花酸二醛不再增加；之后再向缓冲液中添加SynALD蛋白反应，至藏红花酸不再增加。本发明首次公开了体外玉米黄质到藏红花酸的反应过程，依据该反应过程通过优化体外合成条件，首次直接以玉米黄质为底物，通过先后两步酶催化，实现玉米黄质的高效转化，合成纯度较高的藏红花酸，弥补微生物合成的低效率缺陷。

技术领域

本发明涉及酶催化合成技术领域，具体的说是涉及一种体外合成藏红花酸的方法。

背景技术

藏红花酸(Crocetin)是藏红花中有药理活性的脱辅基类胡萝卜素。目前藏红花酸的主要获取方式是从植物中提取分离。虽然已有研究报道在微生物中合成藏红花酸，但是同样受限于藏红花酸产量低、纯度低，从而导致提取、分离和纯化都比较困难。

通过微生物细胞工厂可实现以葡萄糖为碳源从头合成藏红花酸。但是由于引入细胞的代谢路径过长，藏红花酸的合成效率并不高，因此藏红花酸在整个类胡萝卜素产物中的比例也很低，只有5％。因此从微生物细胞中提取纯化高品质的藏红花酸非常困难。目前，已有研究者以藏红花酸为底物，通过体外反应合成藏红花素的案例，但针对藏红花酸的体外合成尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种体外合成藏红花酸的方法，使得所述方法能够在体外以玉米黄质为底物高效的合成藏红花酸，并提高藏红花酸的占比(纯度)。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种体外合成藏红花酸的方法，包括：

步骤1、构建CsCCD2基因和SynALD基因的表达质粒，转入宿主细胞进行蛋白表达，获得CsCCD2蛋白酶和SynALD蛋白酶；或按照相同方法获得CsCCD2蛋白酶的同工酶和SynALD蛋白酶的同工酶；或按照CsCCD2蛋白酶和SynALD蛋白酶的同工酶；或按照CsCCD2蛋白酶的同工酶和SynALD蛋白酶；

步骤2、在含有FeSO₄、L-抗坏血酸、TCEP、catalase和NAD⁺的缓冲液中加入底物玉米黄质和CsCCD2蛋白酶和/或其同工酶反应，至产物藏红花酸二醛不再增加；

步骤3、完成步骤2后再向缓冲液中添加SynALD蛋白酶和/或其同工酶反应，至藏红花酸不再增加。

本发明首次揭示了体外从玉米黄质经酶催化合成藏红花酸的反应过程，CCD2蛋白酶对称切割玉米黄质7,8/7’,8’位的双键合成藏红花酸二醛(Crocetin dialdehyde)的过程分两步进行，即先单边切割7,8或7’,8’合成3-Hydroxy-apo-8'-carotenal，之后继续切割合成藏红花酸二醛(图1)。然后在SynALD蛋白酶的催化下，由藏红花酸二醛先生成中间产物藏红花半醛，然后最终生成藏红花酸；值得注意的是，本发明在反应过程中发现SynALD蛋白酶可能同样可以催化3-Hydroxy-apo-8'-carotenal生成其脱氢产物，而在底物玉米黄质消耗完之后，该脱氢产物能够在CCD2蛋白酶催化下生成藏红花半醛(图2)；这表明CCD2和SynALD蛋白酶同时加入反应体系可能会导致SynALD对3-Hydroxy-apo-8’-carotenal的竞争，阻断3-Hydroxy-apo-8’-carotenal进一步被CCD2催化为藏红花酸二醛，而CCD2催化未知的脱氢产物的反应速率可能比较低，因此制约体外合成藏红花酸的效率。故本发明方法中通过控制SynALD酶的加入时间解决，即先加入CCD2蛋白酶，使玉米黄质完全转化为藏红花酸二醛，之后再加入SynALD酶使藏红花酸二醛转变为藏红花酸。