[发明专利]一种稳定性提高的蔗糖异构酶突变体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种稳定性提高的蔗糖异构酶突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明在高酶活分散泛菌来源蔗糖异构酶的基础上，筛选获得两株单点热稳定性提高的突变菌株V280L，S499F以及一株组合突变体V280L/S499L。三株突变体在热稳定显著提高的同时，酶的活性不受影响。本发明中的这些突变体比天然蔗糖异构酶更适用于工业生产，具有非常巨大的应用前景和产业价值。

技术领域

本发明涉及一种稳定性提高的蔗糖异构酶突变体及其构建方法技术，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

蔗糖异构酶(EC5.4.99.11)，又被称为异麦芽酮糖合成酶，蔗糖变位酶，属于α-淀粉酶13家族，是一种工业应用价值极高的异构酶，可以高效异构蔗糖生成异麦芽酮糖和海藻酮糖，异麦芽酮糖是近年来新兴的一种功能性甜味剂，是糖尿病患者最理想的蔗糖替代糖，在食品、医药等工业中具有广阔的应用前景，而蔗糖异构酶是目前生物酶法工业化生产异麦芽酮糖最有效的酶。

目前已报道的蔗糖异构酶在生物催化过程中显示出有限的热稳定性，如来源于克雷伯氏菌sp.LX3的蔗糖异构酶，在50℃下的半衰期仅有1.8min，来源于肺炎克雷伯菌的蔗糖异构酶在50℃孵育20min后失去其40％的活性，大黄欧文菌来源的蔗糖异构酶在30℃保存24h后活性完全失去活性。

然而，大多数研究只是通过固定化酶或细胞表面展示来提高酶的热稳定性，但它们的热稳定性在工业应用中仍然令人不甚满意。因此，对蔗糖异构酶进行分子修饰以提高其热稳定性的研究将是本发明的研究重点。

发明内容

为了解决目前蔗糖异构酶突变体热稳定性不高的问题，本发明提供了一种蔗糖异构酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶的第280位和/或第499位的氨基酸进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，编码所述蔗糖异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶的第280位的缬氨酸突变为亮氨酸得到的，命名为：V280L，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶的第499位的丝氨酸突变为苯丙氨酸得到的，命名为：S499F，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶的第280位缬氨酸突变为亮氨酸，同时将第499位的丝氨酸突变为苯丙氨酸得到的，命名为：V280L/S499F，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供了一种制备上述突变体的方法，所述方法具体步骤如下：

(1)以SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为模板，根据理性设计的位点，设计定点突变引物，进行PCR扩增获得含有突变位点的基因，然后构建含有编码突变体基因的载体。

(2)将含有编码突变体的基因载体转化到宿主细胞内。

(3)对上一步构建的重组细胞进行筛选验证，获得阳性克隆，然后通过培养发酵产酶，离心收集细胞，利用超声波细胞破碎仪破碎细胞，离心获得含有蔗糖异构酶突变体的粗酶液。

本发明还提供了一种编码上述蔗糖异构酶突变体的基因。

本发明还提供了一种携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pXMJ19载体、pMA5载体、pHT43载体、pET-20b(+)载体和pDXW-10载体中的任一种作为表达载体。

本发明还提供了一种携带上述基因，或上述重组载体的重组细胞。