[发明专利]一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用

说明书

本发明提供一种L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶突变体及其在合成β‑丙氨酸中的应用。本发明通过全质粒定点突变改造L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶通过取代具有氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于Escherichia coli的L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶的第14位，44位，85位氨基酸位点，获得了影响L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶自剪切的突变菌株。本发明通过比较突变体EcoPanD^K14T、EcoPanD^I44V、EcoPanD^V85L和野生型，发现与野生型相比，突变体自剪切水平显著增加，且在发酵后β‑丙氨酸产量均显著增加。

(一)技术领域

本发明涉及L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其在微生物中合成β-丙氨酸方面的应用，属于基因工程技术领域。

(二)背景技术

β-丙氨酸(β-Alanine，C₃H₇NO₂)，易溶于水，是自然界中唯一存在的β型氨基酸。与组成人体蛋白质20种氨基酸之一的α-丙氨酸互为同分异构体。β-丙氨酸作为一种非蛋白氨基酸，在某些细菌、真菌、植物和动物中可以自身合成，而哺乳动物则需从外界环境中摄取。β-丙氨酸广泛被应用在医药、食品、化工和环境等领域，市场前景广泛。首先，工业上很多重要化合物如：3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid)、聚3-羟基丙酸酯(Poly-3-hydroxypropionate)、泛酸(pantothenic acid)、肌肽(camosine)、帕米膦酸钠(balsalazide)和巴柳氮(balasalazide)等是以β-丙氨酸为重要前体或中间体合成的。其次，在食品行业中，β-丙氨酸既是一种食品添加剂改善食品味道，还被作为运动员营养补充剂，改善身体机能。此外，它还可以直接用于生产聚β-丙氨酸，广泛应用于化妆品、水净化和建筑等领域。

L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)是生物体内β-丙氨酸合成的关键酶，能够催化一分子L-天冬氨酸脱去α位羧基生成β-丙氨酸，释放一分子CO₂。生物体内PanD主要包括两种类型，一种是以磷酸吡哆醛(PLP)为辅酶的来源于真核生物昆虫赤拟谷道(Triboliumcastaneum)、果蝇(Drosophilid melanogaster)的PanD酶，另一种是原核生物(Escherichia coli、Bacillus subtilis等)中以丙酮酰基团为辅酶的PanD酶。其中真核生物来源的PanD其催化机理尚无明确报道。原核生物中的PanD在来源、结构和催化机理等方面已经取得了深入的进展，它可以显著影响β-丙氨酸的合成。比如：高丽娟等在E.coliBL21(DE3)中过表达E.coli来源的panD，PanD过表达后与底物L-天冬氨酸进行酶促反应最终生成3.96g/L的β-丙氨酸。随后，Shen等将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的panD在宿主E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达，以L-天冬氨酸为底物最终转化得到12.85g/L的β-丙氨酸，转化效率为97.2％。接着，范雪萍等直接将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)来源的panD基因在E.coli BL21(DE3)中重组表达，以200g/L L-天冬氨酸作为底物，β-丙氨酸最终产量达66.4g/L，转化率达到99.2％。此外，研究还发现，在不同的生物如E.coli、B.subtilis、C.glutamicum和Mycobacterium tuberculosis等中，PanD已经出现了较大的分化，这都与PanD的蛋白结构有关。自1980年，JE Cronan等人通过突变体的方式证明了E.coli中PanD是催化L-天冬氨酸脱羧生成β-丙氨酸的关键酶以后，Webb ME和Ramjee MK等进一步揭示了PanD的催化机理。Webb ME等人通过突变体方式发现E.coli中的PanD蛋白在编码过程中会先形成一个非活性前体(通常叫做π蛋白)，随后，π蛋白在Gly24-Ser25位置通过非水解丝氨酸作用分子内发生自裂解，该反应也称为N→O酰基转移；这一过程产生了一条11kDa的α链，在新的N-末端有一个丙酮酸基，和一条2.8kDa的β链。进一步研究发现，不同来源的PanD酶剪切模式具有较大的差异，首先，在E.coli中PanD蛋白主要以非活性的π蛋白形式表达，之后在激活剂PanZ的作用下，形成PanZ-AcCoA复合物，通过反应构象的选择促进PanD的活化，但是由于细胞内PanZ的不足，导致E.coli中活化的PanD较少。而在C.glutamicum和B.subtilis中，PanD蛋白则不需要激活剂，完全自发裂解，因而具有较高的催化活力。