[发明专利]工程化的Cas效应蛋白及其使用方法

权利要求书

1.工程化的Cas12b核酸酶，其包含一个或多个突变，所述突变增加了对应于参比Cas12b核酸酶中氨基酸残基835至839的柔性区柔性，其中所述氨基酸残基编号基于SEQ IDNO:1，其中所述工程化的Cas12b核酸酶与所述参比Cas12b核酸酶相比具有提高的活性；

其中所述一个或多个突变为在所述柔性区中插入一个或多个G残基，其中所述一个或多个G残基插入在所述柔性区中的柔性氨基酸残基的N末端，其中所述柔性氨基酸残基选自下组：G、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、组氨酸(H)、蛋氨酸(M)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)和脯氨酸(P)；或者

其中所述一个或多个突变为用G残基替换柔性区中的疏水氨基酸残基，其中所述疏水氨基酸残基选自下组：亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)；

其中所述工程化的Cas12b核酸酶在所述柔性区的氨基酸序列突变为SEQ ID NO:83。

2.如权利要求1中所述的工程化的Cas12b核酸酶，所述工程化的Cas12b效应蛋白基于选自下组的参比Cas12b蛋白：嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)的Cas12b蛋白(AaCas12b)，kakegawensis脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacilluskakegawensis)的Cas12b(AkCas12b)，大孢脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusmacrosporangiidus)的Cas12b(AmCas12b)，外村尚芽孢杆菌(Bacillus hisashii)的Cas12b(BhCas12b)，芽孢杆菌(Bacillus)的BsCas12b，芽孢杆菌的Bs3Cas12b，非常脱硫弧菌(Desulfovibrio inopinatus)的Cas12b(DiCas12b)，沉积物莱斯氏菌(Laceyellasediminis)的Cas12b(LsCas12b)，螺旋体菌(Spirochaetes bacterium)的Cas12b(SbCas12b)，和热生肿块芽孢杆菌(Tuberibacillus calidus)的Cas12b(TcCas12b)。

3.如权利要求1中所述的工程化的Cas12b核酸酶，所述工程化的Cas12b效应蛋白基于BhCas12b。

4.如权利要求1中所述的工程化的Cas12b核酸酶，包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列。

5.一种工程化的Cas12b效应蛋白，其包含权利要求1～4中任一项所述的工程化的Cas12b核酸酶。

6.如权利要求5所述的工程化的Cas12b效应蛋白，其中所述效应蛋白能够诱导DNA分子中的双链断裂或单链断裂。

7.如权利要求5所述的工程化的Cas12b效应蛋白，其中所述工程化的Cas12b核酸酶还包含R785A、R911A或D977A的酶失活突变体,其中所述氨基酸残基编号基于SEQ ID NO:7。

8.如权利要求5中所述的工程化的Cas12b效应蛋白，其还包含与所述工程化的Cas12b核酸酶融合的功能结构域。

9.如权利要求8所述的工程化的Cas12b效应蛋白，其中所述功能结构域选自下组：翻译起始结构域、转录阻遏结构域、反式激活结构域、表观遗传修饰结构域、核碱基编辑结构域、逆转录酶结构域、报告分子结构域和核酸酶结构域。