[发明专利]一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法

权利要求书

1.一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA（Streptomyces diastatochromogenes ΔcadA），其特征在于：其构建步骤如下：

提取E. coli DH5α转化子中的重组质粒pJTU 412-ΔcadA，首先将构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素的抗性平板中，挑选阳性转化子于含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37 ℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37 ℃震荡培养至OD₆₀₀=0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中得到阳性转化子菌悬液，置于冰上备用；

其中，所述卡那霉素的终浓度为50-100 μg/mL、安普霉素的终浓度为50-100 μg/mL和氯霉素的终浓度为25-50 μg/mL；

向贝纳特培养基上产孢的淀粉酶产色链霉菌TUST（Streptomyces diastatochromogenes TUST）菌株平板上加入pH 8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30 ℃，180-200 r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50 ℃水浴热激10 min，将孢子悬液冷却至室温后加入M3G培养基，于37 ℃条件下震荡培养2-3 h使孢子萌发，5000 r/min 离心5-10 min收集孢子，用TES缓冲液重悬得到孢子悬液备用；

将步骤的阳性转化子大肠杆菌菌悬液和步骤萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子悬液等体积混合，均匀涂布于含有5 mM MgCl₂的SFM培养基上，30 ℃倒置培养14-18 h后，用含浓度为10-25 mg/mL的萘啶酮酸及含浓度为 10-25 mg/mL的安普霉素的无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性结合子单克隆得到基因工程高产菌株S. diastatochromogenes ΔcadA；

所述赖氨酸脱羧酶基因cadA重组质粒pJTU 412-ΔcadA的构建步骤如下：

敲除组件的获得：

敲除组件包含cadA基因的等位位点，即该基因的上游同源片段及下游同源片段，以及用于替换目的基因的抗性片段即安普霉素抗性作为筛选标记；

以S. diastatochromogenes TUST的基因组为模板，根据cadA基因分别设计上下游同源片段引物序列cadA-L-F/cadA-L-R和cadA-R-F/cadA-R-R；以pSET 152质粒为模板，根据安普霉素Apr抗性基因设计引物序列cadA-apr-F/cadA-apr-R；

在敲除组件上下游两端分别添加8个核苷酸，形成限制性内切酶EcoR I的酶切位点；

引物的序列为：

cadA-L-F：SEQ No.2；

cadA-L-R：SEQ No.3；

cadA-R-F：SEQ No.5；

cadA-R-R：SEQ No.6；

cadA-apr-F：SEQ No.8；

cadA-apr-R：SEQ No.9；

赖氨酸脱羧酶基因cadA上游同源片段的序列为SEQ No.1，赖氨酸脱羧酶基因cadA下游同源片段的序列为SEQ No.4，安普霉素Apr抗性基因的序列为SEQ No.7；

重组质粒pJTU 412-ΔcadA的构建：

以S. diastatochromogenes TUST的基因组为模板，分别扩增目的基因上下游片段作为同源臂，以pSET 152质粒为模板扩增安普霉素Apr片段，利用SOE-PCR将同源左臂、同源右臂以及安普霉素片段进行融合；将纯化后的融合片段和出发载体pJTU 412分别进行EcoR I单酶切，16 ℃条件下，在T4 DNA ligase作用下与融合片段进行过夜连接，连接产物通过化学转化的方法转入到E. coli DH5α感受态筛选转化子，保存；

所述淀粉酶产色链霉菌S. diastatochromogenes TUST为保藏号为CGMCC No.3145的菌株。