[发明专利]一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法

说明书

本发明涉及一种高产ε‑聚赖氨酸的基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA(Streptomyces diastatochromogenesΔcadA)并提高ε‑聚赖氨酸发酵水平的方法，所述高产基因工程菌株的构建步骤如下：步骤1，构建敲除赖氨酸脱羧酶基因cadA质粒pJTU 412‑ΔcadA；步骤2，缺失cadA基因菌株的获得，即高产ε‑聚赖氨酸的基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌ΔcadA。经过实验证实，该链霉菌基因工程菌株在相同情况下较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST生产ε‑聚赖氨酸的能力显著提高了35.6％，为ε‑聚赖氨酸生产提供了优良菌种。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ΔCADA及提高ε-聚赖氨酸产量的方法。

背景技术

ε-聚赖氨酸(ε-poly-l-lysine，ε-PL)是目前发现的两种天然氨基酸同聚物之一(另一种是γ-聚谷氨酸)，产生菌均属于链霉菌属(Streptomyces)、链轮丝菌属(Streptoverticillum)、北里孢菌属(Kitasatospora)和香柱属。ε-聚赖氨酸抑菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌以及一些病毒均有抑制作用，热稳定性好，可直接加入食品一起加工。日本学者Shima和Sakai于20世纪80年代初首次将这种生物防腐剂应用于食品防腐。ε-聚赖氨酸还可作为一种食疗剂，抑制肠道中膳食脂肪的吸收，最终降低肥胖的几率。ε-聚赖氨酸也可用于防治牙周炎疾病，可抑制口腔细菌毒素的产生。除此之外，ε-聚赖氨酸可用于一次性擦布中药溶液的一种组成成分。ε-聚赖氨酸还可用作乳化剂，ε-聚赖氨酸与葡聚糖结合后所得结合物的乳化活性优于商业乳化剂。在水凝胶、生物芯片和生物电子的镀膜材料等方面也具有十分重要的用途。

正是由于ε-聚赖氨酸具有以上优良性质和广阔的市场前景，1989年日本智索股份有限公司(Chisso Corporation)首先利用微生物发酵技术工业化生产ε-聚赖氨酸。2001年，Kahar等提出采用两阶段pH控制策略来提升S.albulus S410菌株ε-聚赖氨酸的产量。随着ε-聚赖氨酸的需求量不断增大，国内外也有许多学者采用诱变育种等手段以期提高ε-聚赖氨酸的产量，Hiraki利用亚硝基胍对野生型菌株S.albulus No.346进行化学诱变，其中一株S.albulus 11011A高产突变株比出发菌株ε-聚赖氨酸产量高出约10倍。目前还未见到通过基因敲除手段，尤其是通过敲除赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase)基因cadA来提高淀粉酶产色链霉菌生产ε-聚赖氨酸的报道。

通过检索，发现如下三篇与本发明专利申请相关的公开文献：

1.一种积累高丝氨酸的ε-聚赖氨酸的发酵方法(CN 104004796 A)，采用淀粉酶产色链霉菌CGMCCNo.3145作为生产菌株，在发酵0-48h，向发酵培养基中添加终浓度为2.5-5.0g/L的L-苏氨酸。其通过抑制支路代谢改变代谢流分布来实现提高ε-聚赖氨酸产量的，是相同原料投入获得更高的产物浓度，副产物浓度降低，纯化简单。

2.毛忠贵等的文章(Differential protein expression ofa streptomycin-resistant Streptomyces albulus mutant in high yield production ofε-poly-L-lysine:a proteomics study)中，在菌株S.albulus M-Z18中过表达了ε-聚赖氨酸合成酶(pls)基因和核糖体回收因子(frr)基因，使ε-聚赖氨酸产量和每单位细胞ε-聚赖氨酸生物合成量分别增加了7.2％和20.3％。

3.徐虹等人的文章(Enhancement ofε-poly-l-lysine productionbyoverexpressing the ammonium transporter gene in Streptomyces albulus PD-1)中Streptomyces albulus PD-1过表达铵转运体基因amtB，重组菌株较原始菌株ε-聚赖氨酸发酵水平提高了57.26％。