[发明专利]羽衣甘蓝表皮蜡质性状的分子标记及其区分方法

权利要求书

1.一种用于区分羽衣甘蓝表皮蜡质性状的分子标记，其特征在于，所述分子标记为酶切扩增多态性序列(CAPS)，所述酶切扩增多态性序列(CAPS)的原始序列的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

2.一种根据权利要求1所述的分子标记区分羽衣甘蓝表皮蜡质性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)羽衣甘蓝基因组DNA提取：

采用CTAB法，提取待测羽衣甘蓝基因组DNA；

(2)PCR扩增原始序列：

PCR反应体系：包括2×Taq酶缓冲液5μL，DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；

PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；

(3)限制性内切酶NcoⅠ酶切PCR产物：

限制性内切酶NcoⅠ识别序列为C^CATGG；

酶切反应体系：PCR产物3μL，NcoⅠ限制性内切酶0.5μL，10×酶切缓冲液2μL，去离子水14.5μL；

酶切反应条件：37℃酶切30分钟；

(4)酶切后PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测：

经凝胶成像仪成像后，当显示出254bp和137bp两条特异性条带时，为表皮蜡质少的羽衣甘蓝；当显示出391bp一条特异性条带时，为表皮蜡质多的羽衣甘蓝。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Taq酶缓冲液含Taq酶0.2U、dNTPs1μM及镁离子。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述方法在羽衣甘蓝发育任意时期均可鉴定羽衣甘蓝蜡质性状。

5.一种用于区分羽衣甘蓝表皮蜡质性状的分子标记的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)羽衣甘蓝的培育：分别培育表皮蜡质多和蜡质少的羽衣甘蓝；

(2)羽衣甘蓝基因组DNA提取：

采用CTAB法，分别提取表皮蜡质多和蜡质少的羽衣甘蓝基因组DNA；

(3)羽衣甘蓝蜡质基因全长克隆引物设计：

全长克隆引物包括上游全长克隆引物和下游全长克隆引物，相应的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；

(4)PCR扩增：

PCR反应体系：包括2×高保真Taq酶缓冲液5μL，上游全长克隆引物1μL，下游全长克隆引物1μL，DNA模板1μL，去离子水2μL，总计10μL；

PCR反应条件：98℃预变性3分钟；98℃变性10秒，54℃退火50秒，72℃延伸2分钟，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；

(5)琼脂糖凝胶电泳：

将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪观察条带位置；

(6)扩增产物回收；

(7)回收产物连接克隆载体，转化大肠杆菌；

(8)测序：

测得叶表皮多蜡质羽衣甘蓝的核苷酸序列为SEQ ID NO：5，叶表皮少蜡质羽衣甘蓝的核苷酸序列为SEQ ID NO：6；

(9)合成用于区分羽衣甘蓝叶表皮蜡质性状的分子标记

根据步骤(8)中所得的核苷酸序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，确定酶切位点为C^CATGG；设计合成所述酶切扩增多态性序列(CAPS)的原始序列的上游引物核苷酸序列SEQID NO：1和下游引物核苷酸序列SEQ ID NO：2。

6.根据权利要求5所述的用于区分羽衣甘蓝表皮蜡质性状的分子标记的获取方法，其特征在于，所述高保真Taq酶缓冲液含高保真Taq酶0.2U、dNTPs 1μM及镁离子。