[发明专利]一种水蛭药材、饮片及炮制品的体外生物活性测定方法

说明书

本发明涉及一种水蛭药材、饮片及炮制品的体外生物活性测定方法，其特征是以胃蛋白酶、胰蛋白酶对水蛭先进行蛋白酶酶解后，再进行凝血酶滴定测定抗凝血酶活性。本发明对于水蛭药材、饮片、炮制品均能进行体外活性检测，且与在体药效结论基本一致。

技术领域

本发明涉及一种水蛭药材、饮片及炮制品的体外生物活性测定方法。属中药领域。

背景技术

水蛭为动物类药材，味咸、苦，性平，归肝经，具有破血逐瘀的功效，临床以口服给药为主，多用于治疗脑血管疾病、冠心病心绞痛、中风偏瘫等，收载于各版的《中国药典》，其药材为水蛭科动物蚂蟥(宽体金线蛭)Whitmania pigra Whitman、水蛭(日本医蛭)Hirudonipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全体，夏、秋二季捕捉，用沸水烫死，晒干或低温干燥；其饮片为洗净，切段，干燥；其炮制品为烫水蛭，为取净水蛭段，照烫法(《中国药典》通则0213)用滑石粉烫至微鼓起。

动物药具有成分复杂、药效物质基础不明确，质控指标与药效关联性不强等特点。目前，大多数动物类中药还是主要依靠性状鉴定、显微鉴定及理化鉴定方法，含量测定项也大多以直接测定蛋白质含量进行质量控制，质控方法缺乏全面性、针对性和专属性，这也是构建和完善动物药材质量评价体系的难点和重点之一。生物活性测定法主要针对的是临床或药理药效作用明确但组分较多且药效物质基础不明确的药材而发展起来的一种质量控制方法。因此，生物活性测定法非常契合动物类中药的特点，可作为质量评控发展的共识性方向。

水蛭是《中国药典》唯一采用生物活性测定方法的动物类中药材，其药材标准采用凝血酶滴定法测定抗凝血酶活性(水蛭饮片和炮制品未进行生物活性测定)，具体为以0.9％氯化钠溶液作为提取溶剂、以凝血酶滴定至产生凝固、以消耗的凝血酶的量来计算抗凝血酶活性，并规定了药材的效价限值：宽体金线蛭的抗凝血酶活性不得低于4.0U/g，日本医蛭的抗凝血酶活性不得低于16.0U/g。此检验方法存在一定的局限性：一是其只能对原药材进行控制，对饮片及炮制品无法进行测定，水蛭饮片和炮制品均需经加热处理，处理后蛋白质已经变性(水蛭素类成分也是蛋白质的一种)，生理盐水无法溶解提取出来，检测不出抗凝血酶活性；二是此生物活性测定法表征的抗凝活性与在体药效作用相关性不强，药典水蛭药材项下凝血酶滴定法体外测定蚂蟥(宽体金线蛭)和水蛭(日本医蛭)的抗凝活性相差4倍多，而大量的动物体内药效学实验结果表明宽体金线蛭和日本医蛭的体内药效活性基本相当、没有像药材生物活性测定结果那样出现效果相差四倍的情况，而且二者在临床口服制剂的疗效也基本相当，分析原因，水蛭药材项下的抗凝血酶活性测定是检测生理盐水提取的大分子水蛭素类物质的作用，但水蛭素主要存在于日本医蛭等吸血水蛭的唾液腺中，非吸血水蛭如宽体金线蛭中尚未发现水蛭素，因此导致体外活性检测二者相差较大，而通过口服后，日本医蛭中的水蛭素等大分子蛋白类物质在胃肠道内被降解为小分子肽才能吸收入血，日本医蛭的水蛭素结构被破坏、抗凝活性减弱，而宽体金线蛭则受影响较小，导致二者在体内抗凝血酶活性基本相当，水蛭的体外生物活性测定方法与体内药效作用相关性不强。

大分子蛋白在胃肠道内降解为小分子肽类物质，才能经肠道跨膜吸收入血发挥其药效作用，因此以大分子蛋白的抗凝血酶活性来界定水蛭药材的优劣不够科学，应该以其体内代谢产物——小分子肽类作为质控指标，才能真正评价水蛭药材的品质优劣。

本发明专利的水蛭体外生物活性测定方法，待测供试品溶液是在体外将水蛭大分子蛋白以蛋白酶酶解为小分子肽类成分，再测定小分子肽类溶液的体外生物活性，这与在体药效活性之间关联性极强，可作为评价水蛭药材、饮片、炮制品的指标。

发明内容

本发明的目的在于提供一种更有效的、临床相关性强的水蛭药材、饮片及炮制品的体外生物活性测定方法。

本发明目的目的是这样实现的：

发明人提供一种水蛭药材、饮片及炮制品的体外生物活性测定方法：