[发明专利]基于高精度质谱的蛋白类泛素化修饰位点检测方法及应用

权利要求书

1.一种基于高精度质谱的蛋白类泛素化修饰位点检测方法，其特征在于，所述蛋白类泛素化修饰位点检测方法包括以下步骤：

步骤S1：构建获得体外SUMO化修饰反应体系，以获得目标蛋白；

步骤S2：对步骤S1所获得的目标蛋白进行胰蛋白酶酶切，获得酶切后的多肽肽段，其中，胰蛋白酶的加入质量与目标蛋白的反应比例为1∶10～1∶100；

步骤S3：将步骤S2获得的多肽通过液相色谱质谱联用分析采集得到多肽质谱数据，经数据解析，得到修饰位点以及核心肽段的序列；

步骤S4：化学合成含有SUMO化修饰位点的同位素标记肽段序列，采用PRM方法进行位点确证，确定一套母-子离子对；

步骤S5：用步骤S4建立的母-子离子对对内源修饰位点进行检测；

所述SUMO化修饰是指SUMO1类泛素化修饰。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述步骤S1中，具体包括如下步骤：

步骤S11：根据需要的目标蛋白，通过基因克隆技术获得目标蛋白的目标基因，并将目标基因克隆进入表达载体从而构建融合表达质粒；

步骤S12：将步骤S10构建获得的融合表达质粒，转入外源基因表达系统中进行外源表达，得到融合蛋白；

步骤S13：纯化所述融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的蛋白类泛素化修饰位点检测方法，其特征在于，在所述步骤S30的纯化为亲和色谱柱纯化。

4.根据权利要求1所述的蛋白类泛素化修饰位点检测方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述液相色谱质谱联用分析采用基于Eksigent NanoLC-Triple TOF 5600色谱质谱串联系统，采用数据非依赖采集模式。

5.根据权利要求1所述的蛋白类泛素化修饰位点检测方法，其特征在于，在所述步骤S4中，具体包括如下步骤：

步骤S31：采用ChopNspice软件预测经酶切之后的SUMO1侧链的碎片离子，采用b系列离子作为诊断离子；

步骤S32：采用Peakview软件在所有采集到的二级质谱图中提取诊断离子信号，根据诊断离子的XIC的峰形、强度和一致性，锁定潜在的SUMO化修饰肽段并确定对应二级质谱图的保留时间和扫描质量范围；

步骤S33：在上述扫描质量范围及保留时间内对一级质谱图进行解卷积处理，计算出潜在的肽段母离子精确分子量；

步骤S34：采用GPMAW软件对目标蛋白的fasta序列进行理论酶切，并采用ChopNspice软件模拟修饰，随后匹配成功的多肽肽段为目标肽段

步骤S35：将目标肽段通过Peakview软件模拟目标肽段的碎片离子并与诊断离子对应的二级谱图进行匹配，完美匹配上的肽段为含有类泛素化修饰位点的序列，得到修饰位点以及核心肽段。

6.根据权利要求1所述的蛋白类泛素化修饰位点检测方法，其特征在于，在步骤S2中，进行胰蛋白酶酶切时，允许一个漏切位点，过滤掉所有只含有1个K的肽段或者仅在C端出现一个K/R的肽段，酶切后获得的多肽肽段采用ChopNspice软件模拟修饰，即将胰蛋白酶酶切后的SUMO1残基肽链，序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求1所述的蛋白类泛素化修饰位点检测方法，其特征在于，在所述步骤S3中，位点确证方法采用MRM质谱采集方法基于nano-HPLC-Triple Quad 5500plus检测系统完成；所述nano-HPLC-Triple Quad 5500plus测系统采用AB Sciex。