[发明专利]基于高精度质谱的蛋白类泛素化修饰位点检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于高精度质谱的蛋白类泛素化修饰位点检测方法及应用，所述蛋白类泛素化修饰位点检测方法包括以下步骤：步骤S1：构建获得体外SUMO化修饰反应体系，以获得目标蛋白；步骤S2：对步骤S1所获得的目标蛋白进行胰蛋白酶酶切，获得酶切后的多肽肽段；步骤S3：将步骤S2获得的多肽通过液相色谱质谱联用分析采集得到多肽质谱数据，经数据解析，得到修饰位点以及核心肽段的序列；步骤S4：化学合成含有SUMO化修饰位点的同位素标记肽段序列，采用PRM方法进行位点确证，确定一套母‑子离子对；步骤S5：用步骤S4建立的母‑子离子对对内源修饰位点进行检测；所述SUMO化修饰是指SUMO1类泛素化修饰。

技术领域

本发明涉及蛋白质翻译后修饰位点的检测，更具体地讲，涉及蛋白质类泛素化修饰位点的检测及应用。

背景技术

蛋白翻译后修饰(post-translational modifications，PTMs)是一种蛋白功能调节的重要方式，对生理和病理条件下蛋白质的结构和功能都至关重要。具体是指蛋白质从翻译起始到形成有功能的蛋白过程中，其氨基酸序列的特定位置与化学基团或者小分子蛋白发生共价结合的过程，通过增减特定修饰基团来改变蛋白质的分子量、疏水性、构象以及稳定性从而影响蛋白质的功能，这些修饰包括磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化、甲基化等。翻译后修饰已经被证明参与基因表达、信号传导、细胞分裂等多种生命进程。其中泛素化修饰介导真核细胞中大部分蛋白质的选择性降解。泛素(ubiquitin，UB)是一类高度保守的小分子量蛋白质，含有76个氨基酸残基，广泛存在于真核细胞中，可与底物蛋白的赖氨酸残基共价连接，形成多聚泛素链从而被蛋白酶体识别而降解。而类泛素蛋白结构与泛素类似，具有保守的泛素结构域，在真核细胞中广泛存在。

类泛素化修饰(SUMOylation)是一种小的泛素相关修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier，SUMO)在E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶的协同作用下通过可逆的共价结合连接到目标蛋白上的过程。该修饰控制蛋白质的构象、稳定性、相互作用和亚细胞定位，因此涉及多个关键的细胞过程，包括细胞周期、凋亡、代谢和应激适应等。类泛素化酶的功能异常可能导致细胞增殖和基因组稳定性的严重缺陷，诱导产生多种类型的肿瘤。此外，已有报道显示抑制类泛素化可诱导myc过表达实体肿瘤的死亡，使得已经产生化疗抵抗性的白血病细胞凋亡，表明SUMO通路是抗癌靶点。类泛素化修饰在肿瘤发生发展过程中发挥着至关重要的作用，定性和定量分析蛋白SUMO化修饰位点对于探究蛋白质SUMO化修饰的生物学效应，寻找疾病治疗靶点具有重要意义。但是目前相对于泛素化，对于类泛素化修饰位点鉴定及定量的研究极少。

一直以来对蛋白质类泛素化修饰位点鉴定的难点在于SUMO化修饰的不稳定性，细胞内源SUMO化修饰会被SENP(SUMO-specific protease)介导的反应消除，导致蛋白SUMO化修饰的可检测量极低，在进一步的鉴定中如何排除非修饰蛋白干扰是一个重要挑战。

目前针对蛋白质类泛素化修饰位点的鉴定方法，主要是利用修饰或者蛋白特异性的抗体对内源性的修饰蛋白/肽段进行富集。然而，基于抗体的检测方法会受到抗体特异性以及通量的限制，难以进行大规模应用。并且，抗体检测精度较低，难以确定赖氨酸残基上修饰发生的位置，无法满足对于位点特异性研究的需求。

另外，位点突变法分析修饰也是常用的鉴定方法之一，该方法的缺陷是必须建立各种突变位点的文库，将所有可能的赖氨酸都突变成精氨酸，此方法工作量大、成本高，并且后期依然要基于抗体进行蛋白免疫印迹(Western blot)验证。

此外，随着质谱技术的发展，质谱方法也逐渐被应用到翻译后修饰位点的分析中，但是由于SUMO化修饰由很长的氨基酸酸支链构成，在质谱中碎裂后的二级谱图极其复杂，另一方面受限于离子化效率，常规分析方法较难获得完整的碎片离子信号，目前仍没有商业化的软件可以直接进行数据分析，是SUMO化修饰位点鉴定的另一挑战。