[发明专利]一种多病原羊支原体肺炎核酸疫苗的构建方法

权利要求书

1.一种多病原羊支原体肺炎核酸疫苗的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：Mo/Mmc基因组的提取；

步骤二：Mo P113/Mmc LppA基因获取；

步骤三：pVAX1-P113-LppA共表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达。

2.根据权利要求1所述的一种多病原羊支原体肺炎核酸疫苗的构建方法，其特征在于：在步骤一中Mo/Mmc基因组的提取具体步骤为：

S1：Mo Y98/Mmc PG3标准株的复苏与培养：

在超净工作台中使用酒精棉球擦拭保存Mo Y98菌株和Mmc PG3标准株的单管式冷冻管表面，用剪刀打开管口，加入改良Hayflick's培养基溶解冻干菌种，将溶液接种于5mLHayflick's培养基，37℃恒温震荡培养箱培养3～5d，当培养基颜色变为黄色时取200μL进行传代，连续传3代，并把每代培养物4℃保存备用；

S2：Mo Y98/Mmc PG3标准株DNA的提取：

取第3代培养产物参照支原体基因组DNA提取试剂盒提取获得Mo、Mmc的总DNA，并运用核酸蛋白测定仪测定核酸浓度。

3.根据权利要求1所述的一种多病原羊支原体肺炎核酸疫苗的构建方法，其特征在于：在步骤二中Mo P113/Mmc LppA基因获取步骤如下：

S1：引物的设计与合成：

参考GenBank中登录的Mo Y98株P113基因和Mmc PG3株LppA基因信息，使用Primer 5.0软件分别设计1对特异性引物，将引物稀释至10pmol/μL，-20℃保存备用；

S2：Mo P113/Mmc LppA的扩增：

以提取的DNA为模板，分别使用Mo P113和Mmc LppA特异性引物构建25μLPCR反应体系：2×Taq PCR Mastermix 12.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板2μL，dd H2O 8.5μL；反应条件：94℃3min，94℃45s，58℃40s，72℃10s，共35个循环；72℃延伸10min；取PCR产物8μL于含核酸染料的1.2％琼脂糖凝胶上电泳，于凝胶成像系统观察结果；

S3：Mo P113/Mmc LppA基因回收纯化：

Mo P113/Mmc LppA基因经PCR扩增，凝胶成像系统观察结果后，使用胶回收试剂盒回收得到目的基因。

4.根据权利要求1所述的一种多病原羊支原体肺炎核酸疫苗的构建方法，其特征在于：在步骤三中pVAX1-P113-LppA共表达的构建及表达具体为：利用基因重组技术、双酶切技术、测序技术手段构建出pVAX1-P113-LppA共表达质粒，转染如大肠杆菌感受态细胞DH5α中，运用无内毒素质粒提取试剂盒得到大量无内毒素质粒，并在细胞培养、间接免疫荧光技术的基础上测定重组质粒在哺乳动物细胞中的表达情况，通过研究发现重组质粒能在MDBK中大量表达，再通过一系列处理得到Mo P113、Mmc LppA核酸疫苗。