[发明专利]一种多病原羊支原体肺炎核酸疫苗的构建方法

说明书

本发明公开了一种多病原羊支原体肺炎核酸疫苗的构建方法，包括以下步骤：步骤一：Mo/Mmc基因组的提取；步骤二：MoP113/MmcLppA基因获取；步骤三：pVAX1‑P113‑LppA共表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达。本发明在前期筛选出的羊肺炎支原体多表位抗原基因MoP113和MmcLppA基础上，通过基因工程方法构建出pVAX1‑P113‑LppA共表达载体，应用间接免疫荧光技术验证重组质粒在MDBK中的表达情况；本发明选择两个不同抗原基因研制出核酸疫苗，可有效针对Mo和Mmc感染引起的羊支原体肺炎提供免疫保护作用，解决目前疫苗研发所面临的诸多问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种多病原羊支原体肺炎核酸疫苗的构建方法。

背景技术

羊支原体肺炎是由丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp. Capri,Mmc)、绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)和山羊支原体山羊亚种(Mycoplasma capricolum subsp.Capricolum,Mcc)等支原体引起的在羊群中普遍流行的接触性传染病，纤维素性肺炎和胸膜炎是其主要特征，被世界动物卫生组织(OIE)列为B类传染病。近年来，我国多个养羊业发达的省区均有羊支原体肺炎的发生和流行的报道，疫病的流行严重影响着养羊业的健康发展，危害日趋加重，给全国养羊业造成巨大经济损失，且我国该病病原以绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种两种病原为主。

免疫接种依然是防治该类传染病的重要措施之一，目前使用的疫苗为灭活疫苗，还存在一些不足：①灭活疫苗的免疫保护效力十分有限，且不能激发保护性细胞免疫应答；②羊支原体肺炎病原种类多样，目前的疫苗主要以Mmc 生产，但Mo和Mmc之间无交叉免疫保护，灭活疫苗存在生产周期长，生产成本高等因素。因此，新型疫苗的开发显得十分迫切和必要。

发明内容

本发明的目的是克服现有羊支原体肺炎灭活疫苗免疫保护效力低下、生产周期长、成本高、Mo和Mmc之间无交叉免疫保护等问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种多病原羊支原体肺炎核酸疫苗的构建方法，包括以下步骤：

步骤一：Mo/Mmc基因组的提取；

步骤二：Mo P113/Mmc LppA基因获取；

步骤三：pVAX1-P113-LppA共表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达。

优选的，在步骤一中Mo/Mmc基因组的提取具体步骤为：

S1：Mo Y98/Mmc PG3标准株的复苏与培养：

在超净工作台中使用酒精棉球擦拭保存Mo Y98菌株和Mmc PG3标准株的单管式冷冻管表面，用剪刀打开管口，加入改良Hayflick's培养基溶解冻干菌种，将溶液接种于5mLHayflick's培养基，37℃恒温震荡培养箱培养3～5d，当培养基颜色变为黄色时取200μL进行传代，连续传3代，并把每代培养物4℃保存备用；

S2：Mo Y98/MmcPG3标准株DNA的提取：

取第3代培养产物参照支原体基因组DNA提取试剂盒提取获得Mo、 Mmc的总DNA，并运用核酸蛋白测定仪测定核酸浓度。

优选的，在步骤二中Mo P113/Mmc LppA基因获取步骤如下：

S1：引物的设计与合成：

参考GenBank中登录的Mo Y98株P113基因和Mmc PG3株LppA基因信息，使用Primer5.0软件分别设计1对特异性引物，将引物稀释至 10pmol/μL，-20℃保存备用；

S2：Mo P113/Mmc LppA的扩增：