[发明专利]一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法

权利要求书

1.一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法，其特征在于，所述方法包括单克隆抗体注射液的预处理和流动注射高效液相色谱检测的步骤；

所述预处理的具体步骤如下：

将固相萃取柱的填料分散于超纯水中，所述超纯水与填料的体积比为(4～6):1，而后离心，去除所述超纯水；

所述填料为以Protein A为配基的亲和层析介质作为填料；

将所述单克隆抗体注射液上样至平衡后的固相萃取柱，收集初始流出液，再使用体积分数为100％的甲醇作为淋洗液进行淋洗，收集后续流出液，而后将所得初始流出液与后续流出液混合，浓缩、干燥后复溶，得到待测样品；

其中，所述单克隆抗体为IgG抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体，且所述单克隆抗体注射液中蛋白的浓度为60～200mg/mL，吐温80的含量为0.005～0.015wt％；

所述高效液相色谱检测使用的流动相包括：

氯化钠0.1～0.15M、十水四硼酸钠0.025～0.03M、乙腈3～5wt％、N-苯基-1-萘胺4～6M和吐温80 2～3mg/L；

所述流动相的流速为1～2mL/min；

所述浓缩采用的方法为真空离心浓缩，所述真空离心浓缩的转速为1000～1500rpm，温度为25～50℃，时间为3～4h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中还包括清洗所述固相萃取柱的步骤；

所述清洗使用的清洗液包括摩尔质量为20～50mM的醋酸水溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的柱温为25～26℃；

所述高效液相色谱检测的进样量为8～10μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的检测器为荧光检测器；

所述荧光检测器的荧光最大激发波长为350nm；

所述荧光检测器的荧光最大发射波长为420nm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括配制标准工作液并绘制标准曲线的步骤；

所述标准工作液中吐温80的终浓度为0.00125wt％～1wt％。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述标准曲线以吐温80的浓度为输入变量，以高效液相色谱检测图谱的峰面积为输出变量。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：通过所述标准曲线和所述高效液相色谱检测得到的峰面积计算待测溶液中的吐温80的含量。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)单克隆抗体注射液的预处理：

将所述单克隆抗体注射液上样至平衡后的固相萃取柱，收集初始流出液，再使用体积分数为100％的甲醇进行淋洗，收集后续流出液，而后将所得初始流出液与后续流出液混合，浓缩干燥后复溶，得到待测样品；

其中，所述固相萃取柱的填料为以Protein A为配基的亲和层析介质，所述填料使用后采用摩尔质量为20～50mM的醋酸水溶液进行清洗，保存；

(2)高效液相色谱检测：

配制流动相，所述流动相包括：摩尔浓度为0.1～0.15M的氯化钠、摩尔浓度为0.025～0.03M的十水四硼酸钠、质量百分比为3～5％的乙腈、摩尔浓度为4～6M的N-苯基-1-萘胺和质量浓度为2～3mg/L的吐温80，所述流动相的流速为1～2mL/min；

所述高效液相色谱检测的进样量为8～10μL，柱温为25～26℃，检测器为荧光检测器，荧光最大激发波长为350nm，荧光最大发射波长为420nm；

(3)标准工作液的配制：

所述标准工作液中吐温80的终浓度为0.00125wt％～1wt％，以吐温80的浓度为输入变量，以高效液相色谱检测图谱的峰面积为输出变量绘制标准曲线；

(4)计算所述待测样品中吐温80的浓度：

根据所述标准曲线和高效液相色谱检测得到的峰面积计算待测溶液中的吐温80的含量。