[发明专利]一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法

说明书

本发明提供了一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法。所述方法包括单克隆抗体注射液的预处理和高效液相色谱检测的步骤；所述预处理的具体步骤如下：将所述单克隆抗体注射液上样至平衡后的固相萃取柱，收集初始流出液，再使用淋洗液进行淋洗，收集后续流出液，而后将所得初始流出液与后续流出液混合，浓缩干燥后复溶，得到待测样品；其中，所述固相萃取柱的填料为以Protein A为配基的亲和层析介质。该方法通过以ProteinA为介质的固相萃取技术，消除了单克隆抗体对吐温80检测结果的干扰，同时固相萃取与流动注射HPLC相结合，使得操作方法更加便捷，检测周期短，数据重现性好。

技术领域

本发明属于生物药分析检测技术领域，具体涉及一种吐温80的检测方法，尤其涉及一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法。

背景技术

吐温80(Tween-80)又名聚山梨酯80，其化学名为聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯。吐温80作为助溶剂、乳化剂和稳定剂，常用于治疗性单克隆抗体注射液制剂中。由于近年来关于吐温80能够诱发过敏反应的报道越来越多，因此建立一种准确有效的吐温80含量的测定方法尤为重要。

目前，用于检测吐温80含量的方法主要有比色法、HPLC-蒸发光散射(ELSD)检测法、水解法、质谱法和HPLC-荧光(FLD)法等。

比色法因对设备要求比较低而应用广泛，例如，CN107300555A公开了一种快速高效测定吐温80含量的比色方法。该方法系在水性介质中，使吐温80的聚乙氧基与硫氰酸钴铵盐在沸水浴加热条件下快速显色反应，定量生成不溶于水的蓝色显色产物，待冷却至室温后，定量加入有机溶剂萃取显色产物，比色法测定吐温80含量。该方法适用于各种药物制剂中药用辅料吐温80的快速定量测定，但该方法耗时、重复性较差，且对蛋白浓度较高样品适用性差。

HPLC-ELSD法结果较准确，应用范围较广，但是ELSD系统易受蛋白污染而影响检测结果；水解法是将Tween 80水解成油酸，利用高效液相色谱-紫外检测器检测，该方法耗时较长，易受油酸稳定性的影响；质谱法需要使用昂贵的仪器，因此使用范围受限；HPLC-FLD法由于将样品直接进样分析，蛋白质在吐温80出峰位置有干扰，因此检测准确度差。

此外，CN103940773A公开了一种快速测定血必净注射液中吐温-80含量的方法。该方法包括如下步骤：(1)向血必净注射液中添加不同质量的吐温-80，配制至少15种含有不同浓度吐温-80的血必净注射液标准品；(2)采集所述血必净注射液标准品的近红外光谱图；(3)采用化学计量学方法，建立所述血必净注射液标准品中吐温-80的含量与所述近红外光谱图之间的校正模型；(4)采集待测血必净注射液的近红外光谱图，并输入至所述校正模型中，即得到待测血必净注射液中吐温-80的含量。该方法作为一种快速测定方法，亦可用于生产过程中血必净注射液关键生产工艺点的中间体的快速在线测定，为生产过程的质量控制提供一种实时在线快速的检测方法。该方法与质谱法同样需要昂贵的仪器，且同样无法排除蛋白质的干扰。

因此，提供一种准确有效的、能够检测单克隆抗体注射液中吐温80的含量且不受蛋白质干扰的检测方法，对于本领域而言具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法。所述方法具有操作便捷，检测周期短，数据重现性好，结果准确度高等优点。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法，所述方法包括单克隆抗体注射液的预处理和流动注射高效液相色谱检测的步骤；

所述预处理的具体步骤如下：

将所述单克隆抗体注射液上样至平衡后的固相萃取柱，收集初始流出液，再使用淋洗液进行淋洗，收集后续流出液，而后将所得初始流出液与后续流出液混合，浓缩干燥后复溶，得到待测样品；