[发明专利]一种筛选幽门螺杆菌脲酶抑制剂的方法

权利要求书

1.一种筛选幽门螺杆菌脲酶抑制剂的方法，步骤是：

(1)HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器的制备与表征；

其中，所述生物传感器的制备方法是：将通过40℃浓硝酸腐蚀Au/Ag合金片1h后制备的纳米多孔金(NPG)薄膜贴附在预处理玻碳电极(GCE)上；随后采用计时电流法将纳米铂(nPt)电沉积在NPG/GCE表面获得nPt/NPG/GCE；最后在该nPt/NPG/GCE表面滴涂纯化的幽门螺杆菌脲酶b亚基(HPUb)，并在4℃自组装24±2h；最终获得HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器；

(2)以HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器检测0～100mM梯度浓度尿素产生的响应电流，根据米氏方程计算得到该生物传感器检测尿素的K_a，尿素和V_max，尿素；

(3)检测不同脲酶抑制剂筛选分析各个抑制剂的抑制类型和/或抑制常数K_i；

其特征在于：

步骤(1)所述HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器的制备方法中，在将nPt电沉积在NPG/GCE表面时采用阴极还原电镀法，其中沉积电解液为含5mM H₂PtCl₆的0.5mol/L H₂SO₄溶液，电流密度为3～7mA/cm²，电沉积时间为90～150s；同时，采用配备有能量色散X射线光谱仪的扫描电子显微镜观察nPt/NPG的微观形态和元素组成；

步骤(1)所述HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器的表征方法是：以制得的HPUb/nPt/NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系在含0.2mol/LKNO₃的1×10^-3mol/L K₃Fe(CN)₆溶液中通过CV法表征各个电极修饰步骤，其中电压范围为-0.4～0.8V，扫描速率为25～100mV/s，共扫描3～10圈；

步骤(2)所述以HPUb/nPt/NPG/GCE生物传感器检测0～100mM梯度浓度尿素产生的响应电流，根据米氏方程计算得到该生物传感器检测尿素的K_a，尿素和V_max，尿素的方法是：

以制得的HPUb/nPt/NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在-1.2～1.4V的电压范围内以及25～100mV/s的扫描速率下通过CV法测量0～100mM梯度浓度尿素的响应电流；50mM pH 8.0的PBS被用作测试底液；将NH₃的氧化峰电流作为测量响应电流；响应电流变化率作为检测指标，其计算公式如等式(1)所示：

其中，I₀和I₁分别表示检测空白底液和尿素溶液的稳态电流值；随后以尿素浓度的倒数对响应电流变化率的倒数通过Lineweaver-Burk作图法得到双倒数曲线并对曲线进行线性拟合；在酶促反应动力学的Lineweaver-Burk图中，K_a和V_max与双倒数曲线的线性回归方程的斜率和截距之间的关系如公式(2)和(3)所示：

根据公式(2)和(3)以及该生物传感器检测尿素的双倒数曲线拟合线性回归方程即可计算得到该生物传感器检测尿素的K_a，尿素和V_max，尿素；

步骤(3)所述检测不同脲酶抑制剂筛选分析各个抑制剂的抑制类型和/或抑制常数K_i的方法是：

基于步骤(2)得到的该生物传感器检测尿素的K_a，尿素，确定3～5倍K_a，尿素作为脲酶抑制剂的测试浓度；通过在0～100mM梯度浓度尿素溶液中分别加入最终浓度为3～5倍K_a，尿素的脲酶抑制剂制备相应的尿素-脲酶抑制剂混合溶液；然后在-1.2～1.4V的电压范围内以及25～100mV/s的扫描速率下通过CV法测量混合溶液的NH₃氧化峰电流，以尿素浓度的倒数对混合溶液的响应电流变化率的倒数通过Lineweaver-Burk作图法得到双倒数曲线并根据公式(2)和(3)计算该生物传感器检测尿素-脲酶抑制剂混合溶液的K_{a，尿素-抑制剂}和V_{max，尿素-抑制剂}；根据酶的抑制理论，当K_{a，尿素-抑制剂}显著大于K_a，尿素，V_{max，尿素-抑制剂}与V_max，尿素没有显著差异时即判定为竞争性抑制；当K_{a，尿素-抑制剂}与K_a，尿素没有显著差异，V_{max，尿素-抑制剂}显著小于V_max，尿素时即判定为非竞争性抑制；当K_{a，尿素-抑制剂}显著小于K_a，尿素，V_{max，尿素-抑制剂}显著小于V_max，尿素，同时V_max，_{尿素-抑制剂}与K_{a，尿素-抑制剂}的比值和V_max，尿素与K_a，尿素的比值没有显著差异时即判定为反竞争性抑制；

此外，根据酶的抑制理论，加入脲酶抑制剂前后Lineweaver-Burk作图所得两条双倒数曲线的斜率与抑制常数K_i的关系如公式(4)所示：

依据尿素-脲酶抑制剂混合溶液的反应动力学双倒数曲线的斜率与尿素溶液的反应动力学双倒数曲线的斜率以及公式(4)即可计算出脲酶抑制剂的抑制常数K_i。