[发明专利]一种检测爆炸物的光合细菌及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种检测爆炸物的光合细菌及其制备方法和应用。所述光合细菌的制备方法简单，将沼泽红假单胞菌中引入外源报告基因，利用菌株体内原有的生物感应元件识别爆炸物分子，通过报告基因表达产物产生信号来实现爆炸物分子的检测。所述光合细菌最终被用来制备沼泽红假单胞菌生物传感器，其含有启动子基因和转录调控蛋白基因、绿色荧光蛋白基因或荧光素酶基因。所述沼泽红假单胞菌生物传感器的检测范围宽、灵敏度高、方法简便、成本低、安全性强、环境友好且适应性强，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程和分子生物学技术领域，具体涉及一种检测爆炸物的光合细菌及其制备方法和应用。

背景技术

传统的地雷等爆炸物检测方法主要有生物探测、金属探测、电磁感应探测、x-射线/中子背散射、声波探测、雷达探测等，这些传统的探测手段具有一定的局限性，如生物探测主要基于动物对于气味的感官反应，由于动物思想不可控制，探测具有很大的不确定性；金属、声波和雷达探测主要基于探测者的主观判断，而电磁感应探测、x-射线/中子背散射虽然探测方法灵敏度较高，但需要有笨重的仪器设备，具有较高的假阳性，并且大多数情况下需要身赴雷区进行现场检测（Onsite detection），具有很大的危险性，并且无法针对目前出现的陶瓷、塑料等新型材质的地雷进行探测。

检测爆炸物的生物感应技术主要由感应元件和报告元件构成。其中感应元件可以感应被检测物质，最常见的是细胞对靶标物质感应的启动子区域或调控蛋白；报告元件可以将感应信号放大至可被计量的程度，常用的有可产生颜色、荧光或生物发光信号的lacZ,gfp, 和lux基因。生物感应技术的优点是：使用方便、简单、可实现雷区外检测（Standoffdetection），更加安全。该方法颠覆了传统检测技术，规避了地雷等爆炸物材质的问题，而且利用微生物进行群体检测可有效地避免个体主观差异对探测爆炸物的影响，提高检测的客观准确性，可与传统的爆炸物检测方法互为补充，提高爆炸物检测的准确性和安全性。大肠杆菌作为研究生命科学的外源基因表达宿主，具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作等特点，因此使用大肠杆菌对于特定化合物的检测具有更简便、更快捷的优点。

以色列科学家Shimshon Belkin报道了对爆炸物分子2,4-DNT的感应元件，即yqjF启动子，利用GFP基因作为报告元件，构建了检测2,4-DNT的生物感应系统，检测限达到0.01mg/L（New Biotechnology, 2020, 59, 65-73）。除利用大肠杆菌作为生物传感器的宿主细胞外，研究人员还开发了基于酿酒酵母（Nat. Chem. Biol., 2007. 3(6), 325-330）和微藻（Biosens. Bioelectron., 2004. 19(10), 1319-1323）的2,4-DNT检测系统。虽然利用生物感应技术检测地雷已取得一定进展，但检测限的单位仍为微克/升级，然而挥发气体中2,4-DNT的浓度仅为纳克/升级，因此亟需提高灵敏度以满足实际检测的需求。另外，大肠杆菌、酿酒酵母和藻菌在自然界环境中不易存活，尤其是大肠杆菌是一种致病菌，在环境中大量投放这些种类的微生物会对生态环境带来很大的影响，因此亟需开发环境友好型微生物作为生物传感器的宿主菌。

发明内容

本发明提供了一种检测爆炸物的光合细菌及其制备方法和应用。所述的光合细菌具有很好的检测待测样品中爆炸物分子的作用，且效果明显。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种检测爆炸物的光合细菌的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）根据沼泽红假单胞菌的转录调控蛋白的氨基酸序列获得其编码的核苷酸序列，再查找其上游启动该编码核苷酸序列的启动子的核苷酸序列；

（2）将所述启动子的核苷酸序列与荧光报告基因分别经纯化、回收、酶切后相互连接，并转化沼泽红假单胞菌，鉴定阳性后得到工程菌株；