[发明专利]微生物分离检测系统及检测方法

权利要求书

1.利用微生物分离检测系统分离检测微生物的方法，所述方法为非疾病诊断目的，其特征在于，

所述微生物分离检测系统包括圆环形微流控芯片、旋转磁场装置、连接元件、步进电机、步进电机驱动器、固定装置、嵌入式装置和智能手机图像分析设备；

所述圆环形微流控芯片上设有n个纺锤状储液腔以及与各储液腔出口相连的弧形反应腔，储液腔用于储存加载的液体，弧形反应腔用于目标微生物的分离与检测；其中，n为大于等于2的整数；

所述旋转磁场装置与所述圆环形微流控芯片通过所述连接元件嵌合连接，圆环形微流控芯片中加载的磁性材料在磁场带动下发生步移；所述连接元件包括中心轴、轴承和轴托；

所述旋转磁场装置包含的两个L型旋转轴在所述步进电机的驱动下进行圆周运动；

所述步进电机驱动器控制所述步进电机运转；

所述固定装置为三层支架，上层可拆卸地固定有嵌合连接的圆环形微流控芯片和旋转磁场装置，中层可拆卸地固定有步进电机，下层可拆卸地固定有步进电机驱动器和嵌入式装置；其中，所述嵌入式装置为单片机；所述嵌合连接的圆环形微流控芯片和旋转磁场装置作为一个整体，通过轴托与步进电机可拆卸地连接；

其中，所述圆环形微流控芯片的结构如下：

所述圆环形微流控芯片为中心具有圆孔的铜钱结构，圆孔的直径大于等于旋转磁场装置中圆柱形磁铁的直径，保证圆环形微流控芯片顺利穿过圆柱形磁铁；

所述圆环形微流控芯片由倒模而成的包含环形微通道的圆环形PDMS与圆环形玻璃片键合而成；

所述弧形反应腔被环形微通道上设有的2n个出气口隔开，形成n个独立的开放式弧形腔体，每个腔体的内侧两端各有一个出气口；

所述圆环形微流控芯片上设有n个呈中心辐射状排列的纺锤状储液腔，各储液腔之间的夹角为360°/n；

所述储液腔靠近芯片中心的一端设有进样孔，另一端为出口，且各储液腔的出口与弧形反应腔连通；

所述旋转磁场装置包括一个圆柱形磁铁、两个L型旋转轴、一根中心轴、两个轴承和一个固定环；

两个L型旋转轴通过穿过圆柱形磁铁的中心轴分别固定在圆柱形磁铁的两端，圆柱形磁铁的中心为空心，中心轴嵌套轴承刚好穿过该空心；

所述中心轴分为上半轴、中轴和下半轴；下半轴的长度大于上半轴；上半轴将一个L型旋转轴通过该旋转轴长端尾部上设有的开孔固定于圆柱形磁铁的一端，下半轴将另一个L型旋转轴通过该旋转轴长端尾部上设有的开孔固定于圆柱形磁铁的另一端；

两个L型旋转轴的尺寸相同；L型旋转轴的短端尾部为半圆形的收缩结构，用于聚集磁感线；

圆环形微流控芯片嵌套于圆柱形磁铁的中部，其中一个L型旋转轴位于芯片上方，另一个L型旋转轴位于芯片下方，且在两个L型旋转轴短端尾部之间形成一个气隙，该气隙的高度大于芯片的厚度；在该气隙处产生一个竖直的磁场，且该磁场对应作用于芯片上的弧形反应腔；

贯穿于圆柱形磁铁的中心轴的下半轴与步进电机轴通过轴托连接；

固定环用于固定圆柱形磁铁，使其在L型旋转轴发生转动时，圆柱形磁铁自身不转动，步进电机通过中心轴带动L型旋转轴发生转动；

所述嵌入式装置用于控制反应时间和反应速度；

所述智能手机图像分析设备用于检测反应结果；

分离检测微生物的方法包括：

S1、将修饰的免疫纳米镍线溶液、含有目标微生物的待测样品溶液、HRP-纳米花溶液、清洗液1、清洗液2和TMB显色液分别按圆环形微流控芯片的顺时针或逆时针方向从进样孔注入到各纺锤状储液腔中；然后通过离心力使储液腔中的液体进入到外围的弧形反应腔中，形成各自独立的液段；

S2、将形成液段的芯片置于旋转磁场中，进行如下操作：

①启动步进电机，带动L型旋转轴在纳米镍线液段进行循环移动，形成纳米镍线网；

②L型旋转轴带动纳米镍线网进入含有目标微生物的待测样品液段循环移动，将目标微生物捕获到纳米镍线网上形成磁性微生物；

③L型旋转轴带动磁性微生物进入HRP-纳米花液段循环移动，进行微生物标记，形成纳米花微生物；

④L型旋转轴带动纳米花微生物进入清洗液1液段循环移动，然后进入清洗液2液段循环移动；

⑤经过清洗后的纳米花微生物在L型旋转轴的带动下进入TMB显色液段循环移动进行酶催化反应；

⑥L型旋转轴带动纳米花微生物进入起始的纳米镍线液段，终止反应，电机停止运行；

⑦反应结束后，通过智能手机图像分析设备对产物颜色进行分析，从而实现对目标微生物的定性和定量检测；

所述修饰的免疫纳米镍线溶液的制备方法包括：

(1)将1M六水氯化镍溶液75μL和乙二醇15mL混合加入烧杯中，加热至100℃；

(2)逐滴滴加0.5mL一水合肼至上述混合物，温度保持在100℃；

(3)继续加热30min，直到深灰色产物形成并漂浮在溶液表面；

(4)收集生成的深灰色产物即纳米镍线，用去离子水结合磁分离清洗3次，无水乙醇结合磁分离清洗2次；

(5)将清洗后的纳米镍线分散在含0.03％w/v聚乙烯吡咯烷酮的乙醇中，得到1mg/mL的纳米镍线溶液；

(6)将纳米镍线溶液进行超声混匀，使其形成均散体系；取500μL纳米镍线溶液加入反应瓶内，用超纯水清洗2次；

(7)将100μL H₂O₂、100μL NH₄OH和500μL去离子水加入上述清洗后的纳米镍线中，将上述混合溶液置于80℃中水浴30min，得到修饰有羟基的纳米镍线；

(8)磁力架回收修饰有羟基的纳米镍线，并用超纯水清洗1次，无水乙醇清洗1次，然后置于烘箱中烘干；

(9)用无水乙醇配制1％[3-(甲氧基硅烷基)丙基]琥珀酸酐溶液，用1％[3-(甲氧基硅烷基)丙基]琥珀酸酐溶液重悬烘干后的修饰有羟基的纳米镍线，之后置于混匀仪上室温过夜反应，得到修饰有羧基的纳米镍线；

(10)次日用磁力架回收修饰有羧基的纳米镍线，用无水乙醇洗涤3次，再用超纯水清洗2次，然后加入1M，pH 9的NaOH溶液500μL，反应5h以上；

(11)用超纯水清洗被碱液重悬的修饰有羧基的纳米镍线3次，再用pH 7.4的PB溶液清洗1次；

(12)加入500μg EDC和NHSS，反应1h，活化羧基；

(13)用pH 7.4的PB溶液清洗修饰有活化羧基的纳米镍线2次；

(14)用420μL pH 7.4的PB溶液复溶修饰有活化羧基的纳米镍线，然后加入1.2mg/mL链霉亲和素溶液41.67μL和200μg脱脂乳，室温反应1h；

(15)用pH 7.4的PB溶液清洗修饰有活化羧基的纳米镍线2次，然后加入1％脱脂乳500μL封闭1h，得到链霉亲和素化镍线；

(16)在500μL PBS溶液中加入60μg链霉亲和素化镍线，磁分离清洗2次，去除脱脂乳溶液；

(17)然后用500μL PBS溶液复溶纳米镍线并加入4μg捕获抗体，室温孵育45min；其中，所述捕获抗体特异性识别并结合所述目标微生物；

(18)磁分离清洗，去除多余的未结合抗体，即得；

所述HRP-纳米花溶液的制备方法包括：

(1)将浓度为3.35mg/mL的针对所述目标微生物的检测抗体溶液20μg、5mg/mL HRP酶溶液180μg加入到1mL的3mM PBS溶液中；

(2)再将20μL的200mM CaCl₂溶液加入步骤(1)的混合液中，室温孵育12h后，15000rpm离心5min，收集沉淀，用超纯水清洗3次，离心得到HRP-纳米花材料，用400μL超纯水复溶，即得。