[发明专利]一种利用5SrRNA鉴定鱼类早期发育阶段生理性别的方法

说明书

本发明公开了一种利用5S rRNA鉴定鱼类早期发育阶段生理性别的方法，步骤是：(1)利用总RNA提取试剂盒或TRIzol试剂常规提取动物细胞总RNA的方法，提取鱼类性腺组织总RNA，利用核酸分析仪测定OD260/280值，判断RNA纯度；利用琼脂糖凝胶电泳法分离总RNA，观察5S rRNA,18S rRNA和28S rRNA的亮度和分布；(2)将提取的性腺总RNA进行微毛细管电泳，根据核酸分析软件所得出的RNA类型覆盖区域面积大小，计算其中5S rRNA占总RNA的比例；(3)根据5S rRNA占总RNA比例判断鱼类早期发育阶段的生理型雌雄，其中5S rRNA比例小于或等于9.0％时判断为精巢组织，5S rRNA比例大于或等于12％时判断为卵巢组织。方法易行，操作简便，在12小时以内实现了100尾以上鱼类个体的生理型性别鉴定，确定了鱼类生理性别。

技术领域

本发明属于鱼类生理性别分子鉴定技术领域，更具体涉及一种利用5S rRNA鉴定鱼类早期发育阶段生理性别的方法。

背景技术

鱼类早期发育阶段生理性别鉴定对于性腺发育相关研究领域、鱼类资源调查、水产养殖等方面都具有重要价值。同时对于大中型鱼类(比如鲟、鳇、鲑鳟鱼类)来说，早期阶段生理性别的鉴定，可以避免后续对于不需要性别(比如鲟类雄鱼)的持续投入，从而开展有针对性地养殖以减少成本，对于提高养殖经济效益具有重要意义。

但是，迄今为止，鱼类早期发育阶段生理性别的鉴定完全依赖于性腺组织学，通过性腺组织样品保存、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、烤片、染色等20多个步骤，制成组织切片，在显微镜下观察才能判断其生理性别，步骤不仅繁琐、耗时长，样品批量处理起来难度非常大；或者采取压片法，利用醋酸洋红染料进行直接、简单染色，在显微镜下观察，此方法在鱼类早期发育阶段卵母细胞较小时，准确率较低。此外，这两种方法都需要将鱼处死，才能获取足够的组织样品，从而进行后续处理和观察。这对于大型或经济价值较高的鱼类来说是无法接受的。更重要的是，养殖过多雄性个体，对于鲟等产业来说是巨大的资源浪费，不仅增加了成本，还阻碍了产业的规模增长。此外，鱼类性别容易受到环境应激条件如应激温度、高密度、低溶氧等的影响，从而出现遗传型性别与表型性别不一致的情况，即存在例如XX雄鱼或XY雌鱼的个体，而性别特异性分子标记只能判断个体的遗传型性别，并不能判断生理型性别。

因此，亟需开发一种简单、快捷、可进行大批量样品处理，并且可以实现非处死采取样品的鉴定鱼类早期发育阶段生理性别的方法。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种利用5S rRNA鉴定鱼类早期发育阶段生理性别的方法，方法易行，操作简便，可在12小时以内实现了100尾以上鱼类个体的生理型性别鉴定，即表型性别鉴定，确定了鱼类生理性别。在必要情况下，可进行非致死的微量取样来鉴定性别。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种利用5S rRNA鉴定鱼类早期发育阶段生理性别的方法，包括以下步骤：

(1)利用总RNA提取试剂盒(康为世纪或Thermofisher Ambion等)或TRIzol试剂等常规提取动物细胞总RNA的方法，提取鱼类性腺组织总RNA，利用核酸分析仪(Nanodrop1000等)测定OD260/280值，用来初步判断RNA纯度；利用琼脂糖凝胶电泳法分离总RNA，观察5S rRNA,18S rRNA和28S rRNA的亮度和分布情况，所述的5S rRNA的大小在130～150个核苷酸之间，其在微毛细管电泳的峰值通常在接近140nt的位置，总RNA的值指所有覆盖区域所产生的面积大小。

(2)将提取的性腺总RNA进行微毛细管电泳，根据核酸分析软件(Agilent2100Expert或LabChip GX等)所得出的各种RNA类型覆盖区域(Time-corrected area，或Fragment area)面积大小，计算其中5S rRNA占总RNA的比例。