[发明专利]基于胎盘源性间充质干细胞研究治疗卵巢早衰的实验方法

权利要求书

1.基于胎盘源性间充质干细胞研究治疗卵巢早衰的实验方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1：充质干细胞的提取与分离，所述充质干细胞为胎盘间充质干细胞或者脐带间充质干细胞，所述充质干细胞进行提取与分离后，进行传代；

S2：体外实验，使用流式细胞术分析比较不同来源，不同代次的充质干细胞之间表型的差异，用实时定量PCR检测不同充质干细胞在免疫相关基因表达上的差异，确认不超过3个最强免疫负调节品种，将PHA刺激的人外周血单个核细胞，与充质干细胞共培养，ELISA检测上清中IFN-γ、TNF-α的分泌；

S3：动物实验，利用小鼠透明带多肽3建立自身免疫性卵巢早衰小鼠模型，通过酶联检测定性检测小鼠血清抗透明带抗体筛选小鼠后，部分给予尾静脉注射不同的MSCs悬液，部分给予尾静脉注射生理盐水/PBS0.5 mL处理。

2.根据权利要求1所述的基于胎盘源性间充质干细胞研究治疗卵巢早衰的实验方法，其特征在于：所述S1中的胎盘间充质干细胞的提取与分离步骤如下，准备胎盘，分离胎盘，用含三抗的生理盐水反复冲洗，直至绒胎膜组织无血污，变成乳白色，从胎膜中剥离绒毛膜组织，并剪成约2.0mm×2.0mm大小的小块，加入0.2%胶原酶消化60min，用200目金属滤网过滤，用生理盐水洗涤后用Lonza间充质专用培养基悬浮所获细胞，用免疫磁珠法筛选中目的细胞，以9000/cm2的密度接种于六孔板/细胞培养瓶中，置于含5%二氧化碳的37℃细胞培养箱中培养24h后，全量换液去除未贴壁细胞，以后每隔3～4d换液1次，直到细胞融合度达到85%时进行1∶3传代。

3.根据权利要求2所述的基于胎盘源性间充质干细胞研究治疗卵巢早衰的实验方法，其特征在于：胎盘间充质干细胞的提取与分离步骤中所述胎盘为新鲜娩出的无菌无钙化的胎盘，使用无菌剪刀将胎盘剪开分离。

4.根据权利要求1所述的基于胎盘源性间充质干细胞研究治疗卵巢早衰的实验方法，其特征在于：所述S1中的脐带间充质干细胞的提取与分离步骤如下，取新鲜娩出的脐带组织，用生理盐水反复冲洗直至脐带组织无血污，变成乳白色，用无菌器械从脐带中剥取华通氏胶，剪成2mm*2mm小块，接种于培养皿或者培养瓶中，放入含5%二氧化碳的37℃细胞培养箱中培养30分钟后加入培养基没过组织块，第6天全量换液、第11天半量换液、镜下观察出现大量细胞时，进行传代。

5.根据权利要求1所述的基于胎盘源性间充质干细胞研究治疗卵巢早衰的实验方法，其特征在于：定义所述S2中3个最强免疫负调节品种为YRK-101-MSC，YRK-102-MSC，YRK-103-MSC；

定义所述S3中设置若干分组，分为空白对照，脐带间充质干细胞组，胎盘间充质干细胞组各10例，YRK-101-MSC，YRK-102-MSC，YRK-103-MSC组各20例，并使用ELISA法检测小鼠血清血清雌二醇、促卵泡素、抗缪勒管激素、透明带糖蛋白抗体；并进行卵巢组织HE染色，使用ELISA法检测血清CD4+CD25+Treg细胞相关因子γ干扰素、转化生长因子β1（TGF-β1）；使用流式细胞术检测分析脾细胞中T细胞亚群变化。