[发明专利]基于胎盘源性间充质干细胞研究治疗卵巢早衰的实验方法

说明书

本发明提供一种基于胎盘源性间充质干细胞研究治疗卵巢早衰的实验方法，包括如下步骤：S1：充质干细胞的提取与分离，所述充质干细胞为胎盘间充质干细胞或者脐带间充质干细胞，所述充质干细胞进行提取与分离后，进行传代。本发明从解决免疫性POF患者自身免疫持续伤害的角度，通过对比不同来源，不同表型，不同比例以及不同代次的间充质干细胞在免疫相关基因位点的表达，体外免疫抑制实验，体内统一的自身免疫性POF小鼠动物模型上的作用的差异化研究，来寻找并验证具有最强免疫负调节/修复功能的细胞来源/制剂，并研究其可能的作用机制，确定针对免疫性卵巢早衰的最佳剂型，然后便于优化工艺流程和使用方法等，找到更好的卵巢早衰的治疗方法。

技术领域

本发明涉及生物干细胞技术领域，具体为基于胎盘源性间充质干细胞研究治疗卵巢早衰的实验方法。

背景技术

卵巢是女性生殖和内分泌器官之一，卵巢的正常功能是保证女性生活质量的重要保障。卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40岁前由于卵巢内卵泡耗竭或因医源性损伤而发生的卵巢功能衰竭。POF是妇科内分泌领域的常见病，其发病率约为1%～3%，女性40岁以前的发生率为1%，30岁以前的发生率为0.1%。近年来，POF的发病率逐年增高，在女性不孕患者中所占的比例亦有逐年上升的趋势。PO对妇女生殖健康的两大威胁主要是雌激素水平降低及生育能力丧失。雌激素水平降低增加了妇女患骨质疏松和冠心病的危险。而处于生育期的妇女提早闭经，生育能力丧失，会导致一系列心理和社会问题，如易出现抑郁、焦虑、人际交往困难、敌对等情绪、社交方面的心理卫生问题以及婚姻生活质量下降。PO的病因涉及遗传学因素、自身免疫因素、酶学障碍、原始卵巢储备过少、卵泡闭锁或耗竭过快、医源性因素、环境及感染因素、心理因素等。免疫因素是PO常见的原因，相关临床研究显示，大约有20%POF患者是由于自身免疫系统无法识别卵巢组织所导致的，20%～30%的POF伴有其他自身免疫性疾病。

间充质干细胞在卵巢早衰治疗中的应用进展，把MSC对于POF的作用归纳为MSCs可归巢于卵巢，不仅可增加卵巢各级卵泡数，改善内分泌功能，还可增加受孕率。研究表明其主要通过作用于卵巢颗粒细胞、原始生殖细胞及卵巢血管等相关细胞和组织或是发挥其免疫作用和抗氧化应激作用而刺激卵巢功能的恢复。

间充质干细胞（MSC）在卵巢早衰的治疗上展现了可能的美好的前景。但是自身免疫问题不解决，输入的细胞会被迅速清除，持续的免疫伤害会抵消掉干细胞的修复作用，即使短期有效果也难以持续。缺少统一的自身免疫性POF小鼠动物模型上的作用的差异化研究方法，进而去寻找并验证具有最强免疫负调节/修复功能的细胞来源/制剂，并研究其可能的作用机制，确定针对免疫性卵巢早衰的最佳剂型。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于胎盘源性间充质干细胞研究治疗卵巢早衰的实验方法，能够方便研究人员寻找并验证具有最强免疫负调节/修复功能的细胞来源/制剂，并研究其作用机制。

为达成上述目的，本发明提出如下技术方案：基于胎盘源性间充质干细胞研究治疗卵巢早衰的实验方法，包括如下步骤：

S1：充质干细胞的提取与分离，所述充质干细胞为胎盘间充质干细胞或者脐带间充质干细胞，所述充质干细胞进行提取与分离后，进行传代；

S2：体外实验，使用流式细胞术分析比较不同来源，不同代次的充质干细胞之间表型的差异，用实时定量PCR检测不同充质干细胞在免疫相关基因表达上的差异，确认不超过3个最强免疫负调节品种，将PHA刺激的人外周血单个核细胞，与充质干细胞共培养，ELISA检测上清中IFN-γ、TNF-α的分泌；

S3：动物实验，利用小鼠透明带多肽3建立自身免疫性卵巢早衰小鼠模型，通过酶联检测定性检测小鼠血清抗透明带抗体筛选小鼠后，部分给予尾静脉注射不同的MSCs悬液，部分给予尾静脉注射生理盐水/PBS0.5 mL处理。