[发明专利]AAV蛋白外壳的检测方法

说明书

本公开涉及AAV蛋白外壳的检测方法以及可应用于该检测方法的试剂盒。本公开的检测方法可以准确定量AAV蛋白外壳的浓度，具有高灵敏度。

技术领域

本公开涉及AAV蛋白外壳的检测方法以及可应用于该检测方法的试剂盒。

背景技术

腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20-26nm之间，含有大小在4.7kb左右的线性单链DNA基因组。AAV最初是在纯化的腺病毒液中发现的一种污染成分所以得名。大多数成年人都感染过AAV病毒，但尚未发现该病毒是任何疾病的致病因素。

重组腺相关病毒(rAAV)是在非致病的野生型AAV基础上进一步改造而成的新型基因载体，由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫原性低、在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗研究中得到了广泛的应用。目前一些新的AAV血清型的特征是通过全身性基因递送大大改善了心脏，肌肉和CNS的转导效率。其他一些在小型动物的肝基因转移中有效。

这些发现为许多遗传和代谢疾病的基因治疗提供了启示。除了鉴定新的血清型外，基因修饰还可以进一步改善AAV载体的临床应用。利用AAV载体的一个问题是其广泛的组织趋向性，其通常导致基因在不需要的组织中转移，并引起异位基因表达的潜在安全隐患。为了提高AAV病毒颗粒的组织特异性和组织靶向能力，衣壳基因的随机诱变除进行合理的工程设计外，是增强衣壳多样性和改变衣壳向目标组织的向性的最有效方法之一。定向进化(例如DNA改组)是AAV衣壳基因遗传工程的最新开发方法之一。

国际专利申请WO 2019241324 A1涉及通过定向进化获得的靶向肝的合成腺相关病毒蛋白衣壳，命名为AAVXL32.1。然而，目前尚未存在特异性识别该蛋白衣壳(AAVXL32.1)的单克隆抗体以及检测方法，无法对其进行准确定量检测。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述缺陷，在第一方面，本公开提供一种AAV蛋白外壳的检测方法，包括：1)将抗体与固相载体联结，形成固相抗体；2)加入抗原，使所述抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物；3)加入生物素化的抗体，使所述生物素化的抗体与固相抗原抗体复合物上的抗原结合，形成夹心；4)加入结合至酶的标记探针，使所述标记探针与生物素化的抗体结合；5)加入底物显色，其中底物在酶的催化下发生颜色变化；6)根据底物的颜色变化，确定待测抗原的浓度。

本公开的检测方法可以准确定量AAV蛋白外壳的浓度，具有高灵敏度。

在一个实施方式中，上述AAV蛋白外壳的氨基酸序列与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％的同一性。在一个优选实施方式中，上述AAV蛋白衣壳的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

在一个实施方式中，上述抗体以小于1.0E-12M的K_D结合上述AAV蛋白衣壳。

在一个实施方式中，上述抗体包含重链可变区的VH CDR1-3和轻链可变区的VLCDR1-3，所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3具有至少80％、85％、90％、95％的同一性，所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6具有至少80％、85％、90％、95％的同一性。

在一个实施方式中，上述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。