[发明专利]一种高产乳酰-N-新四糖的微生物的构建方法及应用

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达了来源于Aggregatibacter actinomycetemcomitans NUM4039的β-1,4-半乳糖基转移酶，来源于脑膜炎奈瑟球菌的β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶，来源于大肠杆菌的UDP-葡萄糖4差向异构酶，并且敲除编码UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的基因、编码葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶的基因和编码β-半乳糖苷酶的基因；利用pACYCDuet-1载体表达编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因，利用pCOLADuet-1载体共同表达编码UDP-葡萄糖4差向异构酶的基因和编码β-1,4-半乳糖基转移酶的基因；所述β-1,4-半乳糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述脑膜炎奈瑟球菌的β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶lgtA基因的序列如SEQ ID NO.1所示；所述UDP-葡萄糖4差向异构酶基因如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌BL21(DE3)。

3.一种生产乳酰-N-新四糖的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述重组大肠杆菌发酵生产乳酰-N-新四糖。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌在35~40℃、180~220rpm培养得到种子液，将种子液按2~5%量加入含有甘油的发酵体系中，培养至OD₆₀₀为0.6~0.8，加入IPTG和乳糖，使得IPTG和乳糖在反应体系中的浓度分别为0.1~0.5 mM、3~5g/L，诱导培养不少于90h。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌在35~40℃、180~220rpm培养得到种子液，将种子液按5~10%的量加入发酵体系中，培养至OD₆₀₀为17±3，加入IPTG和乳糖，使得IPTG和乳糖在反应体系中的浓度分别为0.1~0.5 mM、5~10 g/L，诱导培养不少于45h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应过程中补加乳糖和甘油，以维持甘油浓度不低于6g/L，乳糖浓度不低于5g/L。

7.权利要求1所述重组大肠杆菌在制备乳酰-N-新四糖的中的应用。