[发明专利]一种基于滚环扩增和DNA折纸术的外泌体膜蛋白检测方法

权利要求书

1.一种基于滚环扩增和DNA折纸术的外泌体膜蛋白检测方法，其特征在于，

包括以下步骤：

（1）构建识别单元：构建带有外泌体膜蛋白aptamer和引物链的发夹结构的识别单元；

（2）滚环扩增：将识别单元与外泌体孵育，识别单元与膜蛋白识别后，释放引物链，引发滚环扩增，得到一条长的具有重复序列的DNA单链；

（3）DNA折纸：利用DNA折纸技术，将扩增产物有序折叠，同时引入富含鸟嘌呤的序列，在有K⁺存在的条件下形成G-四联体；

（4）检测：G-四联体与氯高铁血红素孵育后，通过氧化还原反应实现外泌体膜蛋白检测和信号输出。

2.根据权利要求1所述基于滚环扩增和DNA折纸术的外泌体膜蛋白检测方法，其特征在于，所测外泌体膜蛋白为PAMA、EpCAM、HER-2、CD63、CD-81中的任意一种。

3.根据权利要求1所述基于滚环扩增和DNA折纸术的外泌体膜蛋白检测方法，其特征在于，所述的识别单元具有发卡结构，由物质的量相等的两条单链反应得到，一条链由外泌体膜蛋白aptamer与引物链组成，另一条为block序列；

由外泌体膜蛋白aptamer与引物链组成的单链，其序列选自但不限于：SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9；

block序列选自但不限于：SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 8、SEQID NO 10；

构建环DNA的序列如SEQ ID NO 9或者SEQ ID NO 10所示，其中SEQ ID NO 9所示序列为5’端磷酸修饰单链，DNA10为其连接模板DNA；

形成DNA折纸结构的订书钉链的序列如SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或者SEQ ID NO13所示。

4.根据权利要求1所述基于滚环扩增和DNA折纸术的外泌体膜蛋白检测方法，其特征在于，所述的滚环扩增的时间范围是10-60 min。

5.根据权利要求1所述基于滚环扩增和DNA折纸术的外泌体膜蛋白检测方法，其特征在于，所述的滚环扩增的反应时间为30 min。

6.根据权利要求1所述基于滚环扩增和DNA折纸术的外泌体膜蛋白检测方法，其特征在于，

构建识别单元为：

设计一对由两条单链构成的发夹结构，一条链由外泌体膜蛋白aptamer与引物链组成，另一条为block序列，两条单链以浓度比1:1在95℃温度下反应5 min，缓慢降温，得到发夹结构识别单元；

所述的滚环扩增为：

取1~10 μM 识别单元与外泌体提取液混合均匀，37℃孵育30 min，记为混合物I。混合物I与1~5 μM 环DNA，phi29 DNA聚合酶，1 mM dNTP 在1xRCA反应缓冲液混合均匀，30℃反应10-60min，反应液在65℃温度下反应10 min，使DNA聚合酶失活，反应产生的单链DNA用乙醇沉淀，作为脚手架单链DNA被用于进行折纸反应；或者

所述的DNA折纸为：

取5 uL、浓度为100 uM的、富含鸟嘌呤的订书钉链DNA1-3种，混合均匀，作为混合物II，脚手架单链DNA和混合物II以1:5-1:20的摩尔比混合均匀，在含有K⁺的1×TAE-Mg²⁺缓冲溶液中，PCR仪95℃缓慢退火，反应后记为混合物III；或者

所述的检测为：取混合物II与 hemin、H₂O₂以及ABTS溶液混合均匀后，形成的DNA酶催化还原H2O2、氧化鲁米诺化学发光或者氧化ABTS生成蓝绿色的自由基阳离子，监测其在410nm处吸光值的变化。